本研究旨在構(gòu)建牛纖溶酶原激活物抑制劑1（Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）基因真核表達(dá)載體、生物信息學(xué)分析并對(duì)其功能進(jìn)行初探。實(shí)驗(yàn)參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的牛PAI-1基因的CDS序列信息設(shè)計(jì)引物,通過(guò)RT-PCR獲得PAI-1基因片段,將基因片段與pMD-19-T載體連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建pMD-19-T-PAI-1克隆載體,雙酶切回收基因片段,構(gòu)建pcDNA3.1-PAI-1真核表達(dá)載體,經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定構(gòu)建成功。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,48 h后進(jìn)行熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot檢測(cè)PAI-1以及凋亡相關(guān)基因Bcl2、Bax和Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示:pcDNA3.1-PAI-1真核表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的牛PAI-1基因CDS序列完全匹配,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PAI-1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 209 bp,編碼402個(gè)氨基酸,存在35個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn),主要分布在細(xì)胞外。過(guò)表達(dá)PAI-1可顯著提高293T細(xì)胞中PAI-1 mRNA和蛋白表達(dá),抗凋亡基因Bcl2 m... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)畜牧雜志. 2020,56(08)北大核心

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【部分圖文】：

顆粒細(xì)胞cDNA PCR產(chǎn)物鑒定

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，PAI-1蛋白屬于分泌型蛋白，亞細(xì)胞定位顯示主要分布在細(xì)胞外，這與其參與凝血功能相一致�？傆�(jì)預(yù)測(cè)到35個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而蛋白磷酸化對(duì)于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)具有重要作用，說(shuō)明PAI-1可能參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。圖5 PAI-1和凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

牛PAI-1基因編碼氨基酸序列與綿羊、馬、豬、人、狗、大鼠、小鼠PAI-1基因編碼氨基酸序列的同源性分別為95.52%、86.43%、89.55%、85.32%、88.06%、78.86%、76.87%，提示PAI-1基因在不同物種間相對(duì)保守。牛PAI-1基因共編碼402個(gè)氨基酸，分子式為C2042H3189N539O590S20，分子量為45.37 ku，理論等電點(diǎn)為5.96。如表3所示，PAI-1蛋白共包含20種氨基酸，亮氨酸含量最高，為10.4%，半胱氨酸含量最低，為0.2%，包含44個(gè)負(fù)電荷氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）和39個(gè)正電荷氨基酸（精氨酸+賴氨酸）。2.3.2 磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位分析


本文編號(hào)：3372919