干擾素（Interferon, IFN）是脊椎動物病毒防御系統(tǒng)的重要組成部分,主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干擾素又稱λ干擾素（IFN-λ）,是2003年發(fā)現(xiàn)的一種新型干擾素家族。Ⅲ型干擾素不僅具有與Ⅰ型干擾素相似的抗病毒活性,而且具有與Ⅱ型干擾素相似的免疫調(diào)節(jié)功能。IFN-λ受體分布的特異性,表明IFN-Xλ能夠在一些上皮細胞及免疫細胞上發(fā)揮相對獨立和特異的抗病毒作用。本研究以ChIFN-λ為研究對象,利用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達重組ChIFN-λ,初步開展了其抗病毒活性研究。本研究以雞腎組織提取的總RNA為模板,利用RT-PCR方法擴增ChIFN-λ。序列分析表明ChIFN-λ全長561 bp,共編碼186個氨基酸,其中前23個氨基酸構(gòu)成ChIFN-λ,信號肽。亞克隆其成熟蛋白編碼基因492 bp,將其克隆入pET-32a,構(gòu)建原核表達載體pET-32a-ChIFN-λ,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）,利用IPTG誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE分析證實表達產(chǎn)物為36 KD左右的融合蛋白,并且主要以不溶性包涵體存在。利用高親和Ni-NTA層析樹脂純化表達產(chǎn)物,將其作為抗原免疫... 

【文章來源】：揚州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
第一章 綜述Ⅲ型干擾素研究進展
    1 Ⅲ型干擾素的基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白
    2 Ⅲ型干擾素的表達和調(diào)控
    3 Ⅲ型干擾素的受體和信號通路
    4 Ⅲ型干擾素的生物功能概述
        4.1 抗病毒活性
        4.2 抗腫瘤活性
        4.3 免疫調(diào)節(jié)活性
第二章 雞λ干擾素在桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)中表達及其抗病毒作用研究
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 病毒及細胞
        1.3 菌種及質(zhì)粒
        1.4 主要試劑
        1.5 主要溶液配制
            1.5.1 SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)主要試劑配制
            1.5.2 Western blot主要試劑配制
            1.5.3 ELISA主要試劑配制
            1.5.4 蛋白純化主要試劑配制
            1.5.5 其他試劑配制
        1.6 主要儀器
    2 方法
        2.1 ChIFN-λ基因的克隆與序列分析
            2.1.1 雞腎臟組織總RNA提取
            2.1.2 引物設(shè)計與合成
            2.1.3 RT-PCR
            2.1.4 ChIFN-λ基因的克隆與序列分析
        2.2 ChIFN-λ的原核表達
            2.2.1 ChIFN-λ原核表達引物設(shè)計
            2.2.2 ChIFN-λ成熟蛋白基因的克隆
            2.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和條件優(yōu)化
            2.2.5 重組蛋白的大量誘導(dǎo)及純化
        2.3 ChIFN-λ多克隆抗體的制備
            2.3.1 動物免疫
            2.3.2 ELISA試驗
        2.4 表達ChIFN-λ重組桿狀病毒的構(gòu)建
            2.4.1 gp67信號肽融合ChIFN-λ基因的擴增
            2.4.2 轉(zhuǎn)移載體pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的構(gòu)建
            2.4.3 轉(zhuǎn)染昆蟲細胞
        2.5 重組蛋白的表達鑒定
            2.5.1 間接免疫熒光實驗
            2.5.2 Western Blot實驗
        2.6 MTT方法檢測重組ChIFN-λ的細胞毒性
        2.7 CEK細胞的制備
        2.8 半數(shù)組織細胞感染量測定
        2.9 重組ChIFN-λ抗病毒活性測定
        2.10 重組ChIFN-λ抗AIV、NDV效果研究
    3 結(jié)果
        3.1 ChIFN-λ的擴增及序列分析
            3.1.1 ChIFN-λ全基因的RT-PCR擴增
            3.1.2 測序結(jié)果及分析
        3.2 ChIFN-λ原核表達
            3.2.1 ChIFN-λ成熟蛋白基因的擴增
            3.2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-ChIFN-λ的篩選和鑒定
            3.2.3 重組蛋白表達和純化鑒定
            3.2.4 融合蛋白Western Blot檢測
            3.2.5 多克隆抗體的制備
        3.3 表達ChIFN-λ重組桿狀病毒的構(gòu)建及鑒定
            3.3.1 gp67信號肽序列擴增結(jié)果
            3.3.2 ChIFN-λ去除信號肽片段的擴增
            3.3.3 gp67信號肽融合ChIFN-λ基因的擴增
            3.3.4 轉(zhuǎn)移載體pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的酶切鑒定
            3.3.5 穿梭質(zhì)粒pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ的PCR鑒定
            3.3.6 轉(zhuǎn)染Sf9細胞形態(tài)學(xué)變化
            3.3.7 間接免疫熒光試驗鑒定
            3.3.8 重組桿狀病毒W(wǎng)estern Blot檢測及抗病毒活性測定
            3.3.9 MTT方法檢測重組ChIFN-λ的細胞毒性
        3.4 重組ChIFN-λ抗NDV和AIV的效果
            3.4.1 ChIFN-λ抑制NDV F48E8株致細胞病變作用檢測結(jié)果
            3.4.2 ChIFN-λ抑制H9N2亞型AIV致細胞病變作用檢測結(jié)果
    4 討論
全文結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]禽類干擾素研究進展[J]. 馮書營,閆彬,曹穎.  中國家禽. 2013(12)
[2]Ⅲ型干擾素——新型抗病毒細胞因子[J]. 楊祎,侯煒.  生命科學(xué). 2011(08)



本文編號：3343580