產(chǎn)氣莢膜梭菌是畜禽和人類腸道的常在菌,其大量繁殖時產(chǎn)生多種致病毒素可以導(dǎo)致畜禽的感染嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展。目前,通常采用飼料中添加抗生素的方法預(yù)防畜禽的產(chǎn)氣莢膜梭菌病,但這種方式無疑會導(dǎo)致耐藥菌株的形成以及腸道菌群紊亂,因此亟待尋找一種有效可靠的抗生素替代品。噬菌體能特異性感染和裂解產(chǎn)氣莢膜梭菌而又不影響目標細菌之外的微生物,使天然微生物群落不受干擾,可以作為防控產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗生素替代品,但產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧菌,存在噬菌體分離相對困難、噬菌譜窄、抗性發(fā)展快和溶原化的問題,因此本研究根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌流行特點,從環(huán)境中針對性地篩選特異性噬菌體,并對產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組中原噬菌體進行分析,為研發(fā)防控產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體產(chǎn)品提供理論依據(jù)和新的研究思路。本研究以山東省獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)（Varms）為依托,通過細菌分離培養(yǎng)、α毒素基因的檢測和質(zhì)譜分析等多種鑒定方法,從臨床分離不同動物源的產(chǎn)氣莢膜梭菌流行菌株,采用（α、β、ε、ι）毒素基因PCR鑒定毒素基因型,掌握目前產(chǎn)氣莢膜梭菌流行特點。利用PHASTER網(wǎng)站注釋細菌基因組原噬菌體序列和噬菌體特征,通過在線網(wǎng)站VFDB和CARD排查完整原噬菌體區(qū)... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究現(xiàn)狀
        1.1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學特性
        1.1.2 臨床常見的產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染
        1.1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗藥性
        1.1.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌的防控現(xiàn)狀
    1.2 噬菌體與噬菌體治療
        1.2.1 噬菌體概述
        1.2.2 噬菌體作用機制
        1.2.3 噬菌體治療
            1.2.3.1 高精度噬菌體療法
            1.2.3.2 噬菌體雞尾酒療法
            1.2.3.3 噬菌體與抗生素聯(lián)合治療
            1.2.3.4 原噬菌體的開發(fā)
    1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體研究進展
    1.4 研究目的與意義
2 材料和方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 樣品采集
        2.1.2 主要試驗材料
        2.1.3 主要試驗試劑與配制方法
        2.1.4 引物合成
        2.1.5 主要儀器
        2.1.6 主要數(shù)據(jù)分析軟件和網(wǎng)站
    2.2 方法
        2.2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定
            2.2.1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品采集和培養(yǎng)方法
            2.2.1.2 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定
            2.2.1.3 分離株的PCR鑒定
            2.2.1.4 質(zhì)譜分析
            2.2.1.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株的保存
        2.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素基因型鑒定
            2.2.2.1 β 、ε 、ι毒素基因的PCR檢測
            2.2.2.2 β2、NetB、cpe毒素基因的PCR檢測
        2.2.3 原噬菌體預(yù)測
        2.2.4 噬菌體的分離
            2.2.4.1 樣品處理
            2.2.4.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的復(fù)蘇
            2.2.4.3 共培養(yǎng)法分離噬菌體
            2.2.4.4 噬菌體純化
            2.2.4.5 噬菌體的擴增
            2.2.4.6 噬菌體的凍存
        2.2.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體基本生物學特性分析
            2.5.5.1 效價測定
            2.5.5.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體的裂解譜測定
            2.5.5.3 產(chǎn)氣莢膜梭噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測定
            2.5.5.4 產(chǎn)氣莢膜梭噬菌體最適生長溫度測定
            2.5.5.5 產(chǎn)氣莢膜梭噬菌體pH值穩(wěn)定性測定
            2.5.5.6 產(chǎn)氣莢膜梭噬菌體一步生長曲線測定
        2.2.6 噬菌體全基因組分析
            2.2.6.1 噬菌體的濃縮提取和純化
            2.2.6.2 噬菌體全基因組測序
            2.2.6.3 基因組的ORF預(yù)測及功能注釋
            2.2.6.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析和基因組同源性分析
        2.2.7 統(tǒng)計學分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定與遺傳生化分析
        3.1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離
        3.1.2 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的形態(tài)學鑒定
        3.1.3 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要生化鑒定
        3.1.4 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR鑒定結(jié)果
        3.1.5 疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果
        3.1.6 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型鑒定
        3.1.7 cpe毒素檢測
        3.1.8 β2 毒素檢測
        3.1.9 NetB毒素檢測
        3.1.10 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離情況和毒素類型分布
        3.1.11 原噬菌體分析
    3.2 噬菌體的生物學和基因組分析
        3.2.1 噬菌體分離結(jié)果
        3.2.2 噬菌體效價
        3.2.3 噬菌體裂解譜
        3.2.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)
        3.2.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體的pH穩(wěn)定性
        3.2.6 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體的最適生長溫度
        3.2.7 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體的一步生長曲線
    3.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體全基因組分析
        3.3.1 基因組組裝結(jié)果
        3.3.2 噬菌體基因組ORF分析及功能注釋結(jié)果
        3.3.3 噬菌體系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析
        3.3.4 噬菌體基因組同源性分析
4 討論
    4.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分布
    4.2 不同動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型分布情況
    4.3 原噬菌體分析
    4.4 噬菌體的分離方法
    4.5 噬菌體的生物學特性分析
    4.6 噬菌體基因組學分析
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 附錄
8 致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬鏈球菌的烈性噬菌體和前噬菌體[J]. 湯芳,陸承平.  微生物學報. 2015(04)
[2]雞產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 艾地云,邵華斌,張騰飛,詹麗超,羅玲,張蓉蓉,汪宏才,王紅琳,羅青平,溫國元.  動物醫(yī)學進展. 2014(06)
[3]四川地區(qū)雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與基因分型[J]. 倪學勤,宋振銀,曾東,鄭曉麗,Joshua Gong.  中國人獸共患病學報. 2009(08)
[4]多重PCR檢測圈養(yǎng)牛、豬和羊源魏氏梭菌[J]. 王磊,裴蘭英,萬雪,馬保臣,段會勇,柴同杰.  中國預(yù)防獸醫(yī)學報. 2006(01)

博士論文
[1]山東省四大湖（庫）淡水魚產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型調(diào)查及致病機理研究[D]. 蔡玉梅.山東農(nóng)業(yè)大學 2008



本文編號：3170218