通過研究培養(yǎng)條件（包括血清濃度、飼養(yǎng)層細胞及三種生長因子）對水牛精原干細胞（SSCs）增殖的影響,最終建立水牛SSCs體外增殖的培養(yǎng)體系。通過介導生長抑素RNA干擾的PB轉座子轉染SSCs,得到含目的基因片段的SSCs;在移植轉基因SSCs至昆明鼠睪丸后,分析轉基因SSCs的增殖與分化功能。該研究為克隆轉基因水牛提供新途徑；為SSCs的生物學特性、多潛能性及定向分化的表觀遺傳學和精子發(fā)生機理等研究提供技術平臺；結合SSCs的冷凍保存,為水牛的種質資源保存提供新手段；為其他家畜和人的SSCs的研究提供理論參考。1.水牛精原干細胞的體外培養(yǎng)與分子標志探索水牛SSCs特異性分子標志的發(fā)展,體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及其多能性的保持,在水牛的選擇性遺傳修飾中具有重要的意義。本研究取4～5月齡雜交水牛（摩拉×沼澤,49條染色體）睪丸,經(jīng)Western blot發(fā)現(xiàn)水牛睪丸中存在兩種蛋白異構體（135kDa大片段和90kDa小片段）,CDH1為水牛精原干細胞的特異性分子標志；免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)水牛睪丸精原細胞上存在CDH1的表達,且在體細胞中無表達。純化后的精原干細胞（流式分析純化富集效率達到53%）... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻綜述
    1 精原干細胞內(nèi)源性調節(jié)機制研究進展
        1.1 精原干細胞的起源
        1.2 精原干細胞的生物活性
        1.3 SSC龕內(nèi)因子
    2 SSCs表面表型的研究進展
        2.1 表面表型的初步理解
        2.2 造血干細胞和SSCs表面表型的共性
        2.3 GDNF的受體復合物作為一種特定的SSCs表型
        2.4 水牛SSCs表面表型的研究進展
    3 外源生長因子對精原干細胞自我更新的影響
        3.1 GDNF影響SSCs的增殖和正常生精功能
        3.2 嚙齒動物SSCs的體外長期培養(yǎng)體系
        3.3 GDNF與精原干細胞體外長期自我更新
        3.4 bFGF和EGF與SSCs體外自我更新
        3.5 其他體外培養(yǎng)添加物進展
    4 生長抑素
    5 PB轉座子介導RNAi技術
    6 SSCs移植介導轉基因動物生產(chǎn)的研究進展
        6.1 SSCs的移植
        6.2 移植前轉基因
    7 本項目的研究目的和意義
第二章 水牛精原干細胞（SSCS）分子標志篩查與體外培養(yǎng)
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 材料
            2.1.1 實驗動物
            2.1.2 主要儀器和材料
            2.1.3 主要試劑
        2.2 方法
            2.2.1 試劑配制
            2.2.2 樣品的采集
            2.2.3 免疫組化
            2.2.4 Western blot檢測
            2.2.5 精原細胞的分離
            2.2.6 水牛精原干細胞的純化
            2.2.7 流式細胞分析
            2.2.8 飼養(yǎng)層準備
            2.2.9 精原干細胞體外培養(yǎng)
            2.2.10 精原細胞克隆的增殖分析
            2.2.11 免疫細胞化學
            2.2.12 克隆分離和RT-PCR、qRT-PCR檢測
            2.2.13 供體細胞移植
            2.2.14 統(tǒng)計分析
    3 結果與討論
        3.1 CDH1的轉錄水平表達
        3.2 水牛睪丸組織中CDH1定位
        3.3 水牛睪丸組織CDH1蛋白表達
        3.4 水牛SSCs的分離和純化效率
        3.5 體外培養(yǎng)的胚胎成纖維細胞（MEF）
        3.6 清飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中水牛SSCs增殖和克隆數(shù)
        3.7 生長因子培養(yǎng)體系中水牛SSCs增殖和克隆數(shù)
        3.8 體外培養(yǎng)SSCs克隆中特異性分子標志表達
        3.9 生長因子對SSCs克隆的分子標志mRNA水平表達的影響
        3.10 水牛SSCs在受體睪丸中的定植
    4 討論
        4.1 CDH1在水牛精原干細胞中的表達與定位
        4.2 水牛SSCs純化效果
        4.3 水牛SSCs體外培養(yǎng)中增殖特性
        4.4 血清與飼養(yǎng)層體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化
        4.5 生長因子對水牛精原干細胞在體外增殖的影響
第三章 轉基因載體的構建與功能驗證
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 試驗動物和細胞
            2.1.2 干擾載體
            2.1.3 所用試劑
            2.1.4 主要試劑盒
            2.1.5 主要抗體
        2.2 方法
            2.2.1 SS基因RNA干擾載體構建
            2.2.2 SS干擾質粒轉染BHK-21細胞
            2.2.3 細胞總RNA的提取及逆轉錄
            2.2.4 qRT-PCR檢測質粒在mRNA水平的干擾效率
            2.2.5 生長抑素表達水平檢測
            2.2.6 流式檢測轉染后細胞凋亡
            2.2.7 流式檢測轉染后細胞周期
            2.2.8 轉染后凋亡和周期相關蛋白檢測
            2.2.9 統(tǒng)計分析
    3 結果與分析
        3.1 生長抑素RNAi載體構建
            3.1.1 設計及合成的shRNA
            3.1.2 雙鏈退火得到shRNA
            3.1.3 ph1載體質粒驗證結果
            3.1.4 真核表達干擾質粒的鑒定結果
        3.2 生長抑素干擾載體的轉染結果
            3.2.1 轉染效果
            3.2.2 所提總RNA的質量
            3.2.3 細胞激素水平的干擾效率
            3.2.4 細胞在mRNA水平的干擾效果
        3.3 轉染SS干擾質粒對BHK-21細胞的影響
            3.3.1 轉染對細胞周期的影響
            3.3.2 轉染對細胞凋亡的影響
            3.3.3 轉染對BHK-21細胞生長抑素受體的影響
    4 討論
        4.1 關于干擾效果的討論
        4.2 干擾SS后BHK-21細胞凋亡和周期變化
        4.3 干擾SS對BHK-21細胞SSTR的影響
    5 小結
第四章 水牛SSCs的異種移植
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器與耗材
            2.1.3 動物
        2.2 方法
            2.2.1 檢測昆明小鼠對白消安的劑量反應
            2.2.2 移植
            2.2.3 統(tǒng)計分析
    3 結果與分析
        3.1 劑量反應
            3.1.1 受體小鼠的體重變化
            3.1.2 受體小鼠睪酮水平變化
            3.1.3 受體小鼠睪丸組織學變化
        3.2 供體細胞準備
            3.2.1 水牛SSCs的體外轉染效果
            3.2.2 供體細胞熒光鏡檢及移植
        3.3 移植后的受體睪丸分析結果
            3.3.1 受體睪丸中供體SSCs的增殖狀況
            3.3.2 受體睪丸中供體細胞PCR檢測結果
    4 討論
        4.1 白消安劑量優(yōu)化
        4.2 SSCs轉基因途徑
        4.3 受體睪丸中供體SSCs鑒定
        4.4 受體睪丸中供體SSCs的增殖和分化
    5 結論
參考文獻
研究創(chuàng)新點
不足
附錄Ⅰ 重組ph1質粒測序圖譜
附錄Ⅱ 在讀期間發(fā)表的學術論著/論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]新生牛精原干細胞體外增殖調控的研究[D]. 張仕強.西北農(nóng)林科技大學 2007



本文編號：3110585