隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,獲得特異性強(qiáng)且無生物安全隱患的高效啟動子成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)為介導(dǎo),在實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)分離獲得的具有較高調(diào)控能力兼具肌肉組織特異性表達(dá)的a-actin啟動子的基礎(chǔ)上,將蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒中可廣譜表達(dá)外源基因的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性啟動子a-actiin。構(gòu)建豬肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),并在細(xì)胞水平上驗(yàn)證該肌肉特異性誘導(dǎo)系統(tǒng)在表達(dá)外源基因時(shí)是否兼?zhèn)浣M織特異性和可調(diào)控性,為基因治療和外源基因在骨骼肌組織的特異性表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：1.將蛻皮素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒pVgRXR中的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性表達(dá)的a-actin啟動子,選取綠色熒光蛋白EGFP為報(bào)告基因構(gòu)建誘導(dǎo)系統(tǒng)中的反應(yīng)質(zhì)粒pIND-EGFP,用于檢測雙載體表達(dá)系統(tǒng)是否可以成功表達(dá)外源基因。研究結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可啟動外源基因的表達(dá)。2.將以上系統(tǒng)中的EGFP報(bào)告基因替換為p-半乳糖苷酶LacZ基因用于檢測該系統(tǒng)的表達(dá)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該誘導(dǎo)系統(tǒng)報(bào)告基因表達(dá)量在一定的范圍內(nèi)均與誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑量呈正比例關(guān)系,分別在誘導(dǎo)時(shí)間為72h和誘導(dǎo)... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮寫對照表
第一章 文章綜述
    1 前言
    2 組織特異性啟動子
    3 骨骼肌特異性表達(dá)基因a-actin的研究進(jìn)展
    4 蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)
    5 研究目的和意義
第二章 材料和方法
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要儀器和設(shè)備
        1.2 所用實(shí)驗(yàn)試劑
        1.3 所用載體和細(xì)胞
        1.4 常用試劑的配制
            1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑的配制
            1.4.2 β-半乳糖苷酶活性檢測所需試劑的配制
        1.5 主要生物學(xué)軟件
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 調(diào)節(jié)質(zhì)粒pVg-actin載體的構(gòu)建方案
            2.1.1 載體重組的引物設(shè)計(jì)
            2.1.2 PCR產(chǎn)物的檢測、回收及純化
            2.1.3 PCR產(chǎn)物的加尾及純化
            2.1.4 PCR產(chǎn)物的克隆及測序
            2.1.5 T-actin和T-ZP的小量提取及酶切回收
            2.1.6 T-actin和T-ZP的酶切鑒定及片段的回收
            2.1.7 T-ZP-actin的小量提取及酶切回收
            2.1.8 pVg-actin的小量提取及酶切鑒定
        2.2 反應(yīng)質(zhì)粒pIND-LacZ和pIND-MyoD載體的構(gòu)建
            2.2.1 重組質(zhì)粒pIND-LacZ的小量提取及酶切鑒定
            2.2.2 MyoD基因片段的擴(kuò)增
            2.2.3 pVg-actin以及pIND-MyoD可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒小量提取
        2.3 C2C12細(xì)胞系培養(yǎng)
            2.3.1 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
            2.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代
            2.3.3 細(xì)胞的凍存
            2.3.4 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            2.3.5 G418篩選C2C12細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)
            2.3.6 C2C12細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.3.7 C2C12細(xì)胞的穩(wěn)定篩選
            2.3.8 細(xì)胞總RNA的提取
            2.3.9 細(xì)胞總蛋白濃度測定
            2.3.10 β-半乳糖苷酶活性的檢測
            2.3.11 β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.3.12 數(shù)據(jù)的處理及分析
第三章 結(jié)果和分析
    1 豬肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
        1.1 調(diào)節(jié)質(zhì)粒pV-actin載體的構(gòu)建
            1.1.1 豬α-actin啟動子和ZP片段的獲得
            1.1.2 T-actin及T-ZP的構(gòu)建及酶切回收
            1.1.3 T-ZP-actin的構(gòu)建及酶切回收
            1.1.4 pVg-actin的構(gòu)建及酶切鑒定
        1.2 反應(yīng)質(zhì)粒pIND-EGFP/pIND-LacZ/pIND-MyoD載體的構(gòu)建
            1.2.1 pIND-EGFP載體的構(gòu)建和酶切鑒定
            1.2.2 pIND-LacZ載體的構(gòu)建和酶切鑒定
            1.2.3 pIND-MyoD載體的構(gòu)建和酶切鑒定
        1.3 C2C12細(xì)胞系的穩(wěn)定篩選及誘導(dǎo)分化
            1.3.1 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVg-actin/pIND-EGFP質(zhì)粒熒光檢測
            1.3.3 陽性克隆細(xì)胞的檢測
    2 β-半乳糖苷酶含量檢測
        2.1 pVg-actin/pIND-LacZ系統(tǒng)中β-GaL表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系
        2.2 pVg-actin/pIND-LacZ系統(tǒng)中β-GaL表達(dá)量與誘導(dǎo)濃度的關(guān)系
        2.3 不同時(shí)期肌管中β-GaL表達(dá)量與誘導(dǎo)濃度的關(guān)系
        2.4 小結(jié)
    3 pVg-actin/pIND-MyoD載體轉(zhuǎn)染小鼠肌管在mRNA水平上的檢測
第四章 討論
    1 β-半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)的作用
    2 組織特異性啟動子
    3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建
    5 MyoD基因
    6 豬肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的功能驗(yàn)證
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 α-actin啟動子序列（268 bp）
    附錄2 ZP上游序列（1620 bp）
    附錄3 ZP-actin序列（1900 bp）
    附錄4 MyoD序列（960 bp）
    附錄5 EGFP序列（798bp）
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3102754