發(fā)布時(shí)間：2021-03-22 19:09

　　本研究旨在建立一種靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢測綿羊肺炎支原體的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,并對(duì)MO HHHT2017株進(jìn)行全基因組測序,挖掘其中的生物學(xué)信息。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的綿羊肺炎支原體HSP70基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒,建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R²=1.000,斜率Slope=-3.334,擴(kuò)增效率E=99.5%;敏感性高,可以檢測出的最低樣品濃度為1×10¹ copies/μL,是普通PCR的100倍;特異性強(qiáng),能有效區(qū)分巴氏桿菌、鏈球菌和牛支原體等8種病原;重復(fù)性好,組內(nèi)、組間的Ct值變異系數(shù)均小于2%。運(yùn)用本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可簡便、準(zhǔn)確的鑒定綿羊肺炎支原體。該研究成果可為綿羊支原體肺炎的診斷和防控提供技術(shù)支撐。對(duì)MO HHHT2017株全基因組測序分析結(jié)果顯示,其基因組全長1019689 bp,GC含量29.068%;預(yù)測到基因807個(gè),基因占比86.87%;對(duì)全基因組進(jìn)行了CRISPR預(yù)測及COG、GO注釋等生物信息學(xué)分... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PacBioSMRT測序原理

法對(duì) 30 份臨床樣品進(jìn)行檢測，比較兩種方法的檢出率，以驗(yàn)證其實(shí)用性。2.3 結(jié)果2.3.1 常規(guī) PCR 擴(kuò)增結(jié)果將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果如圖 2 所示，電泳條帶出現(xiàn)位置與預(yù)期一致，目的片段大小約為 107 bp。2.3.2 重組質(zhì)粒 PCR 鑒定結(jié)果HSP70 重組質(zhì)粒的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳試驗(yàn)后的結(jié)果如圖 3 所示，電泳條帶出現(xiàn)位置與預(yù)期一致，大小約為 107 bp，表明 HSP70 的目的基因片段與 pMD19-T 克隆載體連接成功。

法對(duì) 30 份臨床樣品進(jìn)行檢測，比較兩種方法的檢出率，以驗(yàn)證其實(shí)用性。2.3 結(jié)果2.3.1 常規(guī) PCR 擴(kuò)增結(jié)果將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果如圖 2 所示，電泳條帶出現(xiàn)位置與預(yù)期一致，目的片段大小約為 107 bp。2.3.2 重組質(zhì)粒 PCR 鑒定結(jié)果HSP70 重組質(zhì)粒的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳試驗(yàn)后的結(jié)果如圖 3 所示，電泳條帶出現(xiàn)位置與預(yù)期一致，大小約為 107 bp，表明 HSP70 的目的基因片段與 pMD19-T 克隆載體連接成功。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]國內(nèi)部分地區(qū)羊支原體肺炎血清學(xué)調(diào)查及分析[J]. 吳錦艷,尚佑軍,陳妍,王光祥,田宏,曹小安,尹雙輝,樊天喜,臧金鳳,欒志舫,王耀杰,王雪瑩,劉湘濤,張志東.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(02)
[2]綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種和精氨酸支原體多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 鄭佳琪,黃海碧,王曉暉,劉文浩,麻昌姣,岳全占,郝永清.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(07)
[3]綿羊肺炎支原體P71蛋白分段表達(dá)及其間接ELISA方法的建立[J]. 黃海碧,鄭佳琪,王仁超,王曉暉,陳德浩,王靈芮,郭逸賢,郝永清.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2015(08)
[4]羊支原體肺炎綜合性防治措施[J]. 王巖.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2015(06)
[5]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 李聰,曹文廣.  生物工程學(xué)報(bào). 2015(11)
[6]碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy）及其研究趨勢[J]. 王帥,陳冠軍,張懷強(qiáng),王祿山.  生物加工過程. 2014(01)
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[9]綿羊肺炎支原體免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究[J]. 許健,儲(chǔ)岳峰,高鵬程,趙萍,賀英,剡根強(qiáng),逯忠新.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2012(02)
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博士論文
[1]蒙古羊全基因組測序及基于轉(zhuǎn)錄組分析的抗寒性狀遺傳基礎(chǔ)研究[D]. 侯成林.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]綿羊肺炎支原體的分離鑒定及全基因組序列的測定和分析[D]. 郝瑞霞.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株的同源性研究及雙重PCR檢測方法的建立[D]. 張明月.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[3]綿羊肺炎支原體HSP70基因遺傳多樣性及其在分子檢測中的應(yīng)用[D]. 韓笑.西南民族大學(xué) 2012
[4]豬肺炎支原體SYBR GREEN熒光定量PCR檢測技術(shù)研究[D]. 同戈.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2007



本文編號(hào)：3094337