外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)既受到表達(dá)載體的啟動(dòng)子影響,又受到外源基因在插入過程中所引起的插入位點(diǎn)效應(yīng)的影響。本實(shí)驗(yàn)室采用原核顯微注射法制備了可以穩(wěn)定遺傳的MyoD和PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠。為了研究影響外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的因素,本試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室保留的F3代的MyoD和PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)世代純繁建系,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因在DNA、RNA和蛋白水平的表達(dá);通過熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR（TAIL-PCR）法對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠中的外源基因MyoD和PPAR-γ2進(jìn)行定位,確定外源基因的插入位點(diǎn),再分析外源基因整合過程中產(chǎn)生的插入位點(diǎn)效應(yīng),為日后應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、測(cè)定PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠和野生型鼠后腿肌肉組織中的甘油三酯含量和PPAR-γ蛋白的表達(dá)情況,檢測(cè)的結(jié)果表明PPAR-γ2陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠肌內(nèi)甘油三酯的含量高于野生型鼠（p<0.05）,PPAR-γ蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達(dá)高于野生型鼠;2、用RT-qPCR法檢測(cè)MyoD轉(zhuǎn)基因鼠各組織中外源基因的表達(dá)量,結(jié)果表明外源基因MyoD在肌肉組織中的表達(dá)量高于其他組織,且后腿肌肉組織中MyoD蛋白的表達(dá)量My... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 引言
    2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建系
    3 外源基因定位的方法及研究進(jìn)展
        3.1 熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR法
        3.2 反向PCR法
        3.3 熒光原位雜交法
        3.4 連接介導(dǎo)PCR法
    4 插入位點(diǎn)效應(yīng)的研究進(jìn)展
        4.1 甲基化的檢測(cè)方法及研究進(jìn)展
            4.1.1 限制性酶切PCR
            4.1.2 甲基化特異性PCR
            4.1.3 變性高效液相色譜法
            4.1.4 亞硫酸鹽測(cè)序PCR
            4.1.5 亞硫酸鹽PCR-SSCP
        4.2 拷貝數(shù)的檢測(cè)方法及研究進(jìn)展
            4.2.1 絕對(duì)定量PCR法
            4.2.2 Southern Blot
            4.2.3 CGH芯片
            4.2.4 高密度SNP芯片
        4.3 其他插入位點(diǎn)效應(yīng)及研究進(jìn)展
    5 研究的目的與意義
第二章 材料方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 載體和質(zhì)粒
        1.3 主要儀器與設(shè)備
        1.4 主要試劑及試劑盒
        1.5 主要溶液的配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 后代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定
            2.1.1 小鼠基因組DNA的提取
            2.1.2 陽(yáng)性鼠的鑒定
        2.2 轉(zhuǎn)基因鼠基因組外源基因拷貝數(shù)的鑒定
            2.2.1 小鼠單拷貝基因重組質(zhì)粒的檢測(cè)
            2.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
            2.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.2.4 陽(yáng)性克隆的檢測(cè)及測(cè)序
            2.2.5 將連接目的片段的pGL3-Basic的重組質(zhì)粒小量提取
            2.2.6 轉(zhuǎn)基因鼠基因組內(nèi)拷貝數(shù)的鑒定
        2.3 轉(zhuǎn)基因鼠目的基因在RNA水平表達(dá)情況的驗(yàn)證
            2.3.1 轉(zhuǎn)基因鼠不同組織RNA的提取
            2.3.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
            2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MyoD轉(zhuǎn)基因鼠不同組織中MyoD基因的表達(dá)情況
        2.4 轉(zhuǎn)基因鼠目的基因在蛋白水平表達(dá)情況的驗(yàn)證
            2.4.1 轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠肌肉組織蛋白的提取
            2.4.2 Western blot檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量
        2.5 轉(zhuǎn)基因鼠肌肉組織甘油三酯的測(cè)定
        2.6 外源基因定位
            2.6.1 熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR
            2.6.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
            2.6.3 PCR產(chǎn)物的回收及純化
            2.6.4 膠回收產(chǎn)物連接T載體
            2.6.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.6.6 陽(yáng)性克隆的檢測(cè)及測(cè)序
        2.7 亞硫酸鹽PCR-SSCP
            2.7.1 外源基因CpG島分析
            2.7.2 基因組DNA亞硫酸鹽處理
            2.7.3 亞硫酸鹽處理產(chǎn)物PCR擴(kuò)增
            2.7.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
            2.7.5 PCR產(chǎn)物的回收及純化
            2.7.6 膠回收產(chǎn)物連接T載體
            2.7.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.7.8 陽(yáng)性克隆的檢測(cè)及測(cè)序
            2.7.9 測(cè)序結(jié)果SSCP檢測(cè)
        2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第三章 研究結(jié)果與分析
    1 PPAR-γ2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠的檢測(cè)
    2 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因穩(wěn)定遺傳的判定
    3 肌肉組織中外源基因PPAR-γ2 的表達(dá)情況
    4 肌肉組織內(nèi)甘油三酯的測(cè)定
    5 TAIL-PCR定位外源基因PPAR-γ2 的結(jié)果
    6 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因存在的插入位點(diǎn)效應(yīng)
        6.1 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因拷貝數(shù)的判定
        6.2 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因其他的插入位點(diǎn)效應(yīng)
    7 MyoD陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠的檢測(cè)
    8 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因穩(wěn)定遺傳的判定
    9 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因MyoD的表達(dá)情況
        9.1 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因MyoD的組織表達(dá)譜分析
        9.2 肌肉組織中外源基因MyoD的表達(dá)情況
    10 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因存在的插入位點(diǎn)效應(yīng)
        10.1 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠外源基因拷貝數(shù)的判定
        10.2 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化的鑒定
        10.3 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠外源基因其他插入位點(diǎn)效應(yīng)的鑒定
第五章 討論
第六章 結(jié)論
    1 本試驗(yàn)取得的結(jié)果
    2 后期研究設(shè)想
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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