發(fā)布時間：2021-03-08 16:07

　　精子尾部是由位于曲精細管上皮的精原干細胞經歷有絲分裂、減數(shù)分裂后,在精子變態(tài)過程中形成。尾部是精子的代謝與運動器官,與精子的活動能力有密切關系,而精子的活動能力是完成受精的重要前提條件。當精子的活力低下、尾部畸形或行動方向不規(guī)則都可能導致不育。研究精子尾部形成的分子機理對于探尋精子形成及精子結構異常造成的精液品質不良的成因具有重要意義。目前的研究還無法還原精子尾部的體外生成過程。本研究選擇在精子尾部起重要作用的基因Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr,通過克隆獲得完整CDS序列,對其序列特征、時空表達規(guī)律、表達產物的亞細胞定位進行分析研究,并探索基因的過表達對體外培養(yǎng)精原干細胞分化的影響,從而為深入研究精子尾部發(fā)生的分子機理及調控機制奠定基礎。全文結果如下：一、采用RT-PCR和RACE的方法克隆了豬Odf2、Odf3、Tektin4基因及Cabyr基因的3種剪接體cDNA序列；對所獲序列利用軟件分析編碼氨基酸的結構、同源性比較及分子進化樹的構建。結果表明Odf2基因cDNA長3300bp,編碼蛋白長度為810個氨基酸,有連續(xù)的Coiled coil結構；Odf3基因cDNA... 

【文章來源】：揚州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫
文獻綜述
    1 精子發(fā)生的過程及參與精子發(fā)生的基因
        1.1 精子的結構
        1.2 精子發(fā)生的過程
        1.3 參與精子發(fā)生的基因
    2 參與精子尾部發(fā)生的相關基因研究進展
        2.1 精子尾部的發(fā)生過程
        2.2 精子尾部主要結構單元的功能及相關基因
        2.3 精子尾部結構異常造成不育
    3 精原干細胞培養(yǎng)和體內外誘導分化的研究進展
        3.1 精原干細胞的來源
        3.2 精原干細胞體外的長期培養(yǎng)
        3.3 精原干細胞維持和分化的分子調控機制
        3.4 精原干細胞的移植
        3.5 精原干細胞的體外誘導分化
    4 本研究的目的與意義
    參考文獻
第一章 Odf2、Odf3、Tektin4及Cabyr基因的克隆
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 睪丸組織RNA提取與cDNA的合成
        1.4 Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr基因cDNA序列的克隆
        1.5 RACE
        1.6 序列的生物信息學分析
    2 結果與分析
        2.1 豬Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr基因的克隆
        2.2 豬Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr序列及編碼蛋白的結構分析
        2.3 豬Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育樹分析
            2.3.1 同源性分析
            2.3.2 序列的多重比較
            2.3.3 進化樹構建
    3 討論
    4 結論
第二章 Odf2、Odf3、Tektin4及Cabyr基因的時空表達規(guī)律
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 梅山豬組織RNA提取與cDNA合成
        1.4 Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr基因組織表達特異性檢測
        1.5 Odf2,Odf3,Tektin4及Cabyr基因定量表達分析
        1.6 睪丸石蠟切片的制作
        1.7 附睪尾精子數(shù)測定
        1.8 數(shù)據分析與統(tǒng)計
    2 結果與分析
        2.1 梅山豬Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr基因的組織表達特征
        2.2 Odf2,Odf3,Tektin4和Cabyr基因在不同日齡段睪丸的表達規(guī)律
        2.3 睪丸組織結構
        2.4 梅山公豬附睪尾精子數(shù)測定
    3 討論
        3.1 Odf2,Odf3,Tektin4Cabyr基因組織表達特異性
        3.2 不同日齡梅山豬睪丸基因的表達與精子的發(fā)生
    4 結論
第三章 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因的亞細胞定位
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 重組表達載體的構建及鑒定
        1.4 融合表達載體轉染NIH-3T3細胞
        1.5 融合表達載體轉染后目的基因mRNA的RT-PCR檢測
        1.6 多克隆抗體的制備與檢測
    2 結果與分析
        2.1 重組表達載體的鑒定
        2.2 重組質粒轉染NIH-3T3細胞
        2.3 RT-PCR檢測融合蛋白在細胞中的表達
        2.4 pcDNA3.1重組載體質粒鑒定
        2.5 間接免疫熒光檢測抗體的效價及亞細胞定位
    3 討論
    4 結論
第四章 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr在精子中的表達
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 精子RNA的提取與反轉錄
        1.4 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因在精子RNA中的檢測
        1.5 間接免疫熒光檢測蛋白在成熟精子中的定位
    2 結果與分析
        2.1 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因在精子RNA的表達
        2.2 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr在精子中的定位
    3 討論
    4 結論
第五章 豬精原干細胞體外培養(yǎng)與鑒定
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 豬精原干細胞的分離培養(yǎng)與純化
        1.4 精原干細胞的鑒定
    2 結果與分析
        2.1 豬精原干細胞的形態(tài)和AKP染色
        2.2 標記基因的檢測
    3 討論
    4 結論
第六章 利用豬和小鼠的SSCs驗證Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因的功能
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑
        1.2 實驗設計
        1.3 半定量PCR檢測豬精原干細胞體外分化的影響
        1.4 熒光定量PCR檢測小鼠精原干細胞系體外分化的影響
    2 結果與分析
        2.1 轉染重組質粒后的精原干細胞
        2.2 轉染重組質粒后Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr基因mRNA水平的鑒定
        2.3 過表達目的基因對于豬精原干細胞體外分化的影響
        2.4 不同濃度的RA對于小鼠精原干細胞分化的影響
        2.5 RA誘導后過表達目的基因對于精原干細胞系體外分化的影響
    3 討論
        3.1 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr過表達對于豬精原干細胞體外分化的影響
        3.2 Odf2、Odf3、Tektin4和Cabyr過表達對于小鼠精原干細胞系體外分化的影響
    4 結論
參考文獻
主要結論與意義
特色與創(chuàng)新點
不足及下一步工作建議
附圖
致謝
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本文編號：3071305