旨在篩選牛卵泡發(fā)育關(guān)鍵負調(diào)控因子可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART）的相互作用蛋白及其受體。本研究采集3頭健康母牛雙側(cè)卵巢,分離卵泡后刮取顆粒細胞（granulosa cells, GCs）混樣;采用跨膜蛋白Extraction試劑盒提取膜蛋白,運用Protein G瓊脂糖磁珠與重組CART蛋白、Anti-CART抗體共孵育（n=3）;洗脫CART-蛋白復合物進行二級質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析;獲得的蛋白經(jīng)可信度過濾,利用生物信息學技術(shù)對其進行功能聚類分析,通過CELLO V2.5軟件對蛋白進行亞細胞定位和跨膜區(qū)分析;獲得7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors, GPCRs）,經(jīng)ProtScale軟件分析其胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)區(qū)段特點,符合神經(jīng)肽與受體結(jié)合結(jié)構(gòu)特點的GPCR作為CART的候選受體。抽提的膜蛋白經(jīng)免疫親和層析（n=3）后,分別鑒定出149、557和298個相互作用蛋白,經(jīng)篩選剔除重復蛋白,共鑒定出620個蛋白。多數(shù)據(jù)庫集功能富集分析表... 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學報. 2020,51(12)北大核心

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【部分圖文】：

GPCR跨膜區(qū)特征分析

獲得的620個蛋白經(jīng)GO、COG、KEGG和IPR通用功能數(shù)據(jù)庫進行功能注釋(圖1),共有487個蛋白獲得GO注釋,283個蛋白獲得COG注釋,620個蛋白獲得KEGG注釋,608個蛋白獲得IPR注釋;大多數(shù)蛋白獲得2個以上數(shù)據(jù)庫集注釋,其中230個蛋白均獲得4個數(shù)據(jù)庫集注釋。對已注釋的功能分類條目進一步篩選,獲得許多可能參與牛卵泡發(fā)育和信號傳導的蛋白聚類(表2),如參與信號傳導活性的GNAS、GNG8和JUP,參與類固醇生物合成的HSD3B,參與細胞凋亡或增殖調(diào)節(jié)的OPA1和S100A11,參與Notch信號通路的ERH;參與胞膜形成的蛋白有10個;參與細胞生長和死亡的蛋白有29個; 包含信號識別受體結(jié)構(gòu)域的蛋白有SRPRB。表2 蛋白功能聚類分析Table 2 Protein functional cluster analysis 注釋系統(tǒng)Annotation system 聚類Class 類型描述Description 蛋白數(shù)Protein number 蛋白Protein GO 細胞組分 膜組分 35 COIII, LAMP2, COX2, DAG1, BSG, SLC39A9, DSG1, CDIPT, SYNGR2, PHB, PLXNB2, MAL2, LGALS3BP, LMAN1, DSC1, ND1, YIPF5, ACE2, B3GAT3, STT3A, YIPF3, LMAN2, PHB2, GLG1, DHCR7, SCARB2, SFXN1, SEC61A1, SLC39A7, SYPL1, STT3B, Uncharacterized protein, STX12, STOML2, SEC11A 三聚體G蛋白復合物 1 GNG8 分子功能 信號轉(zhuǎn)導活性 3 GNAS, GNG8, JUP 受體活性 6 ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGB7, STRA6, SCARB2 受體結(jié)合 3 FGA, FGG, FGB Ca2+通道調(diào)節(jié) 1 STIM1 蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合 3 YWHAQ, YWHAE, YWHAZ 跨膜轉(zhuǎn)運活性 1 GJA1 生物過程 信號肽加工 3 SPCS2, SPCS3, SEC11A 類固醇生物合成 1 HSD3B 細胞凋亡 1 OPA1 GPCR信號通路 2 GNAS, GNG8 細胞增殖調(diào)節(jié) 1 S100A11 Notch信號通路 1 ERH 蛋白跨膜轉(zhuǎn)運 16 SLC25A24, ABCD1, Tom40A, Uncharacterized protein, SLC25A5, VDAC1, SLC39A9, VDAC2, SLC25A13, SLC16A1, SLC25A1, SLC39A7, SFXN1, SLC25A6, VDAC5P, ABCD3 Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運 3 ATP2A1, ATP2A3, ATP2A2 COG 細胞應(yīng)答、重組、修復 2 DDX31, APOA1 信號傳導機制 9 ABHD16A, CALM2, ADIA, MYL1, MYL6, PDCD6, RNASEL, SLC25A24, SBSN 胞膜形成 10 PLOD3, GBA, SAMM50, PLXNB2, PLOD1, HSD3B, C1QC, SAMM50, C1QA, COLGALT1

經(jīng)PredictProtein對篩選獲得的3個GPCRs結(jié)合位點分析表明(圖4),ZMPSTE24在5～6跨膜區(qū)間胞內(nèi)環(huán)220～348區(qū)段存在3個可能與G蛋白結(jié)合的位點(圖4A);HM13在5～6跨膜區(qū)間胞內(nèi)環(huán)278～289區(qū)段不存在蛋白結(jié)合位點(圖4B);GPR108在5～6跨膜區(qū)間胞內(nèi)環(huán)428～447區(qū)段不存在蛋白結(jié)合位點(圖4C)。因此,可選擇ZMPSTE24作為CART的候選受體,后期進行深入研究。圖3 GPCR跨膜區(qū)特征分析


本文編號：3011395