發(fā)布時間：2021-01-31 18:33

　　為研究豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）ORF7蛋白的亞細胞定位及其在TGEV復(fù)制中的作用。本研究通過RT-PCR擴增TGEV ORF7基因,將其與真核表達載體pEGFP-C1和pEGFP-N1相連接,構(gòu)建表達載體pGFP-ORF7（GFP融合在TGEV ORF7的-NH2端）和pORF7-GFP（GFP融合在ORF7的-COOH端）。分別將這兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ST細胞,western blot檢測融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP的表達。通過生物信息學(xué)分析和激光共聚焦確定TGEV ORF7蛋白的亞細胞定位。在此基礎(chǔ)上,通過細胞病變觀察和熒光定量PCR檢測TGEV ORF7蛋白對TGEV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,本研究正確構(gòu)建了真核表達載體pGFP-ORF7和pORF7-GFP,western blot檢測結(jié)果表明融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP均正確表達,TGEV ORF7蛋白大小約為9 ku;結(jié)合生物信息學(xué)分析和激光共聚焦共定位結(jié)果顯示TGEV ORF7特異性的定位于ST細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,其定位和其N端的信號肽序列有關(guān);熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,過表達ORF7蛋白后TGEV ... 

【文章來源】：中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2020,42(06)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

TGEV ORF7基因的PCR擴增結(jié)果

將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細胞24 h后的觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pGFP-ORF7、pORF7-GFP和空載體pEGFP-C1的細胞中均能觀察到綠色熒光。表明標(biāo)簽蛋白GFP無論融合在TGEV ORF7的-NH2端和-COOH端，融合蛋白均可以表達。同時，western blot的鑒定結(jié)果顯示，融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP分子質(zhì)量均約為35 ku,GFP蛋白的分子質(zhì)量為27 ku，據(jù)此推算TGEV ORF7蛋白的分子質(zhì)量約為9 ku（圖2）。上述結(jié)果表明TGEV ORF7蛋白在ST細胞中均得到正確表達。2.3 TGEV ORF7蛋白信號肽的生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

通過生物信息學(xué)軟件（http://ipsort.hgc.jp/predict.cgi），對TGEV ORF7蛋白結(jié)構(gòu)進行生物信息學(xué)分析，肽段序列分析閾值為0.953，評分高于0.953及以上的序列成為信號肽的可能性大。TGEV ORF7蛋白分析結(jié)果顯示，其N端的第1～30個氨基酸（MLV-FL HAVFI TVLIL LLIGR LQLLE RLLLN）的信號肽序列區(qū)域預(yù)測值為2.1933，即圖中紅色肽段區(qū)域，遠高于信號肽預(yù)測的閾值（圖3）。初步表明TGEV ORF7蛋白的N端1～30個氨基酸具有信號肽序列特征。2.4 TGEV ORF7蛋白的亞細胞定位結(jié)果

【參考文獻】：
期刊論文
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