發(fā)布時間：2020-10-16 00:17

　　 精原干細胞(SSCs)是一種特殊的、也是唯一能夠將雄性哺乳動物的遺傳物質遺傳給子代的二倍體細胞。目前,SSCs已被應用于轉基因動物的生產、男性不育癥的治療等領域。然而,SSCs的體外培養(yǎng)技術尚不完善,與SSCs增殖有關的通路和機制尚不明確。為了研究表皮生長因子(EGF)和血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)對山羊SSCs體外增殖的影響,本研究將60-75日齡的山羊睪丸(n=6)剪碎后,利用兩步酶消化法得到睪丸單細胞懸液,然后通過兩次差速貼壁法分離純化山羊SSCs,采用堿性磷酸酶染色法及免疫熒光染色法鑒定山羊SSCs。隨后,單獨添加不同濃度的EGF和PDGF-BB,并聯合添加EGF和PDGF-BB培養(yǎng)山羊SSCs。利用甲基噻唑基四唑(MTT)法分別檢測SSCs培養(yǎng)3天,6天和9天后的吸光度,篩選最佳單獨添加濃度和配伍添加濃度;然后,利用western blotting檢測空白對照組及3個最佳濃度試驗組中的ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表達量,運用real time PCR技術檢測空白對照組及3個最佳濃度試驗組中BAD、BCL2和BAX基因的相對表達量;最后,添加MEK1/2的特異性抑制劑PD0325901后,再次檢測空白對照組及3個最佳濃度試驗組中的ERK1/2蛋白、磷酸化ERK1/2蛋白、BAD、BCL2和BAX基因的表達量。主要研究結果如下:1.睪丸單細胞懸液經兩次差速貼壁純化后,能夠獲得純度較高的SSCs。染色結果顯示,純化后的細胞經鈣鈷法堿性磷酸酶染色后呈AKP陽性,SSCs被染色成黑色;免疫熒光染色結果表明,純化后的細胞大量表達SSCs的標記分子THY1和PLZF。2.與對照組相比,單獨添加25 ng/mL EGF或35 ng/mL EGF均可以顯著促進山羊SSCs的自我更新(P0.05),但兩者之間差異不顯著(P0.05);單獨添加20 ng/mL的PDGF-BB的效果最佳(P0.05);同時添加25 ng/mL的EGF和20 ng/mL的PDGF-BB對山羊SSCs的增殖效果顯著高于其他組合(P0.05),培養(yǎng)6 d后,其OD_(490)為0.736。3.Western blotting結果顯示:與對照組相比,3個最佳試驗組的ERK1/2蛋白的表達均有不同程度的升高,其中聯合添加20 ng/mL PDGF-BB+25 ng/mL EGF處理組的增幅最大,單獨添加20 ng/mL的PDGF-BB處理組變化最小;添加MEK1/2的特異性抑制劑后,4個處理組的ERK1/2蛋白的表達水平均降低,但3個試驗組的變化幅度小于對照組。對照組的磷酸化ERK1/2蛋白的表達量均明顯低于其他3個試驗組,后者大約是前者的3~5倍;添加特異性抑制劑后,4個處理組的磷酸化ERK1/2蛋白的表達量降低至原先的10%~30%。4.real time PCR結果表明:與對照組相比,3個試驗組的BCL2基因表達量均上調。其中,聯合添加20 ng/mL PDGF-BB+25 ng/mL EGF處理組的細胞抗凋亡能力顯著高于其他組(P0.05),25 ng/mL EGF組的BCL2表達水平顯著高于對照組(P0.05),然而20 ng/mL PDGF-BB組中的抗凋亡基因BCL2表達水平與對照組相比差異不顯著(P0.05);與其他所有試驗組相比,對照組的促凋亡基因BAX和BAD的表達水平顯著升高(P0.05),而試驗組之間差異均不顯著(P0.05)。添加PD0325901后,所有處理組中的抗凋亡基因BCL2的表達量極顯著降低(P0.001),僅為原先的10%~20%,而BAX和BAD表達水平極顯著升高(P0.001)。結論:單獨或聯合添加EGF和PDGF均有利于促進山羊SSCs的自我更新,我們推測這兩種生長因子可能是通過Ras/ERK1/2信號通路來調控山羊SSCs磷酸化ERK1/2蛋白的表達,進而提高SSCs的抗凋亡能力。
【學位單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

圖 1-1 SSCs 自我更新和分化示意圖（Komeya and Ogawa 2015）注：實心箭頭虛心剪頭表示 SSCs 分化，虛心剪頭表示 SSCs 自我更新。Fig.1-1 Schematic view of self renewal and differentiation of SSCs (Komeya and Ogawa 2015).Note: Solid and broken arrows indicate differentiation and self renewal, respectively.哺乳動物精子發(fā)生起始于性原細胞（gonocytes）向SSCs的轉化，然而由于物種特異性的不同，精子發(fā)生的起始時間因物種的不同而有所差異。嚙齒類動物的精子發(fā)生一般起始于出生后5~7 d（5~7 day post partum，5~7 dpp），家畜通常需要數月才能完成由性原細胞向SSCs的轉化，如豬的精子發(fā)生常起始于出生后2~3個月（Zheng et al. 2014b），而人類則需要在出生后10~13年才開始進行精子發(fā)生（Dym et al. 2009）。1.2 精原干細胞的分離與富集1.2.1 精原干細胞的分離一般來說，睪丸中的 SSCs 的數量極少，有研究發(fā)現嚙齒類動物睪丸中的 SSCs 大約占其總的生殖細胞數的 0.02%~0.03%，約占總精原細胞數的 1.25%，大約只有 10.6%的未分化的精原細胞屬于 SSCs，小鼠的每個睪丸中大約有 35000 個 SSCs（Meistrich and

步驟見附件Ⅲ。 結果與分析.1 睪丸單細胞懸液利用機械分離結合兩步酶消化法可以獲得山羊睪丸單細胞懸液。此時，懸液中類繁多，細胞形態(tài)、大小不均一，SSCs 純度較低（見圖 2-1A）。.2 山羊精原干細胞的純化經差速貼壁純化后，從睪丸單細胞懸液中獲得純度較高的 SSCs，純化后的細胞卵圓形，其細胞大小基本均勻一致（見圖 2-1 B）。

大小基本均勻一致（見圖 2-1 B）。法純化山羊精原干細胞。（A）差速貼壁前，即睪丸單壁后。Scale bar=400 μm。n of goat SSCs using differential plating. (A) before diffee single cell suspension; (B) after differential plating. Scal胞的鑒定堿性磷酸酶（AKP）染色表明，體外培養(yǎng) 10 d 后，SSCs 出現小的細胞克狀沉淀（圖 2-2）。
【參考文獻】

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本文編號：2842454