由于大量的脂肪沉積以及新陳代謝失調(diào)導(dǎo)致的肉雞屠宰品質(zhì)不佳、免疫力低下、死亡率增加,猝死癥、腹水癥等與代謝相關(guān)疾病頻發(fā)等,給生產(chǎn)造成非常大的困擾和經(jīng)濟損失。已有很多研究證明,采用適度水平的限制飼養(yǎng)可有效的改善上述問題,同時哺乳動物最近的研究發(fā)現(xiàn),免疫與代謝在生理及疾病中的相互影響。一方面,大量的能量攝入產(chǎn)生代謝與免疫方面的異常,另一方面,免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞)在多層面受到內(nèi)部能量代謝的調(diào)節(jié)。這種存在于免疫應(yīng)答和能量代謝之間的相互作用,揭示了正確調(diào)節(jié)和管理能量攝入,保持兩者之間微妙的平衡對于機體健康至關(guān)重要。因此能量限制對于增進健康和延長壽命的機制一直受到密切關(guān)注,雖然相關(guān)研究已擴展到很多動物模型動物,但究其分子機制仍有爭議。同樣能量限制對于肉雞免疫器官的分子效應(yīng)以及免疫和代謝之間的相互作用尚缺乏研究報道。為了研究能量限制對肉雞免疫機能影響的分子機理,本研究在飼養(yǎng)試驗的基礎(chǔ)上以肉雞脾臟為研究對象,通過高通量測序技術(shù)篩選能量限制誘發(fā)的脾臟差異表達(dá)基因并進行生物信息學(xué)綜合分析,結(jié)合能量限制引起的肉雞生長性能、免疫機能表觀效應(yīng)探索能量限制增強機體免疫機能的分子機理,闡明能量限制增進動物健康和延長壽命的潛在機制。本研究從以下三個方面進行試驗研究:試驗一,能量限制對肉雞生長性能及免疫機能的影響采用單因素試驗設(shè)計,選用健康的22日齡雄性科寶(Cobb)肉雞72只,逐只稱重后,隨機分為對照組(不限能)、試驗1組(限能15%)和試驗2組(限能30%)。每個試驗處理組24只雞,每只雞單籠飼養(yǎng)(每只雞為一個重復(fù))。分別在28日齡和42日齡屠宰。研究不同水平能量限制對科寶肉雞生長性能、免疫器官指數(shù)及外周血淋巴細(xì)胞濃度等的影響,試驗結(jié)果如下:(1)28日齡,末重、日均采食量和日增重對照組均顯著高于試驗1組和試驗2組(P0.05)、試驗1組顯著高于試驗2組(P0.05),料重比對照組與試驗1組和試驗2組比較差異不顯著(P0.05);42日齡,末重、日均采食量和日增重對照組顯著高于試驗1、2組(P0.05),試驗1組顯著高于試驗2組(P0.05),料重比試驗2組顯著高于試驗1組和對照組(P0.05),試驗1組和對照組比較差異不顯著(P0.05)。(2)28日齡,雞法氏囊指數(shù)試驗2組顯著大于試驗1組和對照組(P0.05),試驗1組和對照組比較差異不顯著(P0.05);胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)三個處理組之間沒有差異。42日齡,脾臟指數(shù)試驗2組顯著大于試驗1組和對照組(P0.05);法氏囊指數(shù)及胸腺指數(shù)三個處理組之間差異不顯著(P0.05)。(3)28日齡,血清中免疫球蛋白IgM的含量試驗1組和試驗2組顯著高于對照組(P0.05),試驗1組和試驗2組比較差異不顯著(P0.05)。IgG三個處理組之間差異不顯著(P0.05)。IgA試驗2組顯著高于對照組(P0.05)。42日齡,IgM的含量三個處理組之間差異不顯著(P0.05),IgG、IgA的含量試驗1組和試驗2組顯著高于對照組(P0.05),兩個試驗組之間沒有差異。(4)28日齡時CD3+和CD4+淋巴細(xì)胞的比例,對照組與兩個試驗組比較有升高的趨勢,但沒有達(dá)到顯著水平(P0.05),而CD8+淋巴細(xì)胞試驗2組顯著高于對照組和試驗1組(P0.05),對照組和試驗1組之間沒有差異(P0.05)。42日齡,CD3+、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞對照組和試驗1組、試驗2組比較差異不顯著(P0.05),但都有升高的趨勢。(5)28日齡,血清中葡萄糖、甘油三酯和低密度脂蛋白在三個處理間差異不顯著(P0.05);總膽固醇含量,試驗2組顯著低于對照組(P0.05);高密度脂蛋白含量試驗1組和試驗2組顯著低于對照組(P0.05),試驗2組顯著低于試驗1組(P0.05)。在42日齡,葡糖糖、低密度脂蛋白三個處理組之間沒有差異,膽固醇含量試驗2組顯著低于對照組(P0.05),甘油三脂含量試驗2組顯著低于試驗1組和對照組(P0.05),試驗1組和對照組比較差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明能量限制降低了肉雞的生產(chǎn)性能,改善了肉雞脂類代謝及免疫機能。試驗二能量限制致雞脾臟差異表達(dá)基因的功能注釋與分析分別選取28、42日齡脾臟提取總RNA,采用高通量測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選差異基因并進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示:(1)28日齡,試驗1組共有26個基因差異表達(dá),試驗2組有70條基因差異表達(dá)。42日齡,試驗1組141個基因差異基,試驗2組108個基因差異表達(dá)。(2)28日齡試驗1組和試驗2組與對照組比較有15條共同差異表達(dá)基因;42日齡試驗1組和試驗2組與對照組比較共有29條共同差異表達(dá)基因。(3)對差異基因進行GO分析發(fā)現(xiàn):28日齡,試驗1組和對照組比較差異基因沒有顯著富集的GO條目,試驗2組和對照組差異基因主要富集到趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、脂肪酸應(yīng)答、免疫應(yīng)答、刺激應(yīng)答及免疫過程這些與免疫及脂類代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。42日齡,試驗1組和對照組比較,顯著富集的差異基因主要參與的生物學(xué)過程包括脂類代謝、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)糖基化以及抗原加工提呈等;試驗2組和對照組比較差異基因主要富集在核糖核酸酶活性、趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性及細(xì)胞凋亡過程等。(4)經(jīng)過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn):28日齡試驗1組和對照組比較差異基因主要富集在腸道免疫網(wǎng)絡(luò)IgA產(chǎn)生通路以及細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用通路,試驗2組和對照組比較主要富集到的通路有:A型流感、粘著斑、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用通路、mTOR信號通路、Toll-like受體信號通路以及Jak-STAT等通路,但均未達(dá)到顯著富集。42日齡試驗1組和對照組比較差異基因主要富集在蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路、腸道產(chǎn)生IgA免疫網(wǎng)絡(luò)等通路其中顯著富集在蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路。試驗2組和對照組差異基因主要富集于細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用通路、腸道免疫網(wǎng)絡(luò)IgA產(chǎn)生通路、吞噬體通路以及調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架通路,其中顯著富集于細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用通路。這些結(jié)果顯示能量限制導(dǎo)致脾臟差異基因主要參與到與免疫、物質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)加工等相關(guān)的通路及生物學(xué)過程。試驗三TNFSF13B基因調(diào)節(jié)肉雞免疫作用機制研究以UMNSAH/DF-1為細(xì)胞模型,通過構(gòu)建TNFSF13B沉默siRNA載體,探索TNFSF13B調(diào)節(jié)肉雞免疫的作用機制可能的分子基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):沉默TNFSF13B基因極顯著下調(diào)NF-κB(p≤0.001)和TGFβmRNA(p≤0.01)表達(dá),同時免疫印跡試驗發(fā)現(xiàn)NF-κBp65和NF-κBPp65蛋白表達(dá)量極顯著下調(diào)(p≤0.001)。以上結(jié)果揭示了TNFSF13B調(diào)控NF-κB和TGF-β基因的表達(dá)以及激活NF-κB通路是其對機體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的分子水平的作用機制之一。結(jié)論:能量限制一定程度上降低了肉雞的生長性能,但提高了肉雞免疫器官指數(shù)、血清中免疫球蛋白的含量以及外周血中T-淋巴細(xì)胞的含量;同時還發(fā)現(xiàn)能量限制改善了脂類代謝。通過進一步對能量限制誘發(fā)的肉雞脾臟差異表達(dá)基因的測序、篩選、鑒定等進行生物信息學(xué)綜合分析,明確了能量限制導(dǎo)致脾臟差異基因主要參與到與免疫、物質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)加工等相關(guān)的通路及生物學(xué)過程。通過沉默TNFSF13B基因發(fā)現(xiàn),TNFSF13B調(diào)控NFκB和TGF-β基因的表達(dá)以及激活NFκB通路。
【學(xué)位單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S831.5
【部分圖文】：

稱為 28 日齡對照組（E_C）。依此類推，獲得 28 日齡試驗 1 組(E_CR_1，能量限制 15%)、28 日齡試驗 2 組（E_CR_2，能量限制 30%）、42 日齡對照組（L_C）、42 日齡試驗 1 組（L_CR_1，能量限制 15%）和 42 日齡試驗 2 組（L_CR_2，能量限制 30%）。樣品檢測合格后，構(gòu)建 cDNA 文庫。構(gòu)建原理圖如上圖所示。文庫構(gòu)建完成后，使用 Q-PCR 方法對文庫的有效濃度進行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度＞2nM），檢測合格的文庫添加到 Illumina HiSeq 2000 測序平臺上，所測序列為單端 100 bp，數(shù)據(jù)量 5G。4.1.8 測序數(shù)據(jù)評估與分析獲得原始測序序列(Sequenced Reads)后，去除接頭和低質(zhì)量序列得到 Clean reads。在參考雞(Gallus gallus)的基因組的情況下，通過如下流程進行生物信息分析。然后，使用 TopHat1.4.0 版本將 Clean reads 比對到雞(Gallus gallus)的基因組上[150]。雞基因組參見：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-72/fasta/gallus_gallus/dna。

L_CR_2 726 196 142.3 1.862 2.771 1.5 8.7A B C D E F M圖4-2 總RNA電泳圖（A ：E_C，B：E_CR_1，C：E_CR_2，D ：L_C，E：L_CR_1，F(xiàn)：L_CR_2， M：Marker）Figure 4-2Theelectrophoresis detections of total RNA（A ：E_C，B：E_CR_1

量的增加而增加，則說明測序還沒有鋪蓋到要檢測的大部分基因；反之，如果增加測序量而得到reads種類并未隨之增加，則說明測序覆蓋度已經(jīng)檢測大部分基因。本試驗定量飽和曲線檢查如圖4-8所示。

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本文編號：2824104