腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)是一類特殊的人獸共患和食源性病原菌,它存在于正常的腸道菌群中,但卻能夠?qū)е聶C體其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生兒腦膜炎等,嚴重威脅著人和動物的健康。有效疫苗的缺乏、耐藥性的增加和生物被膜的形成給ExPEC防控帶來了巨大的困難。生物被膜(Biofilm)是細菌的一種特殊生存形式。與浮游菌不同,生物被膜能夠抵御機體的免疫清除作用,導致抗生素和消毒劑的作用效果下降,引起機體感染的反復發(fā)生。在食品加工設備和食品原料表面的生物被膜給食品安全造成嚴重危害。因此,研究生物被膜形成機制和控制對策具有重要意義。外膜蛋白TolC是構成革蘭氏陰性菌外排泵的重要的成分,是細菌對多種抗菌藥的抗性的重要原因。本實驗室前期研究表明TolC蛋白缺失會造成ExEPC在M9高滲培養(yǎng)基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)TolC缺失后會引起Cpx雙組份系統(tǒng)周質(zhì)間隙蛋白CpxP編碼基因的上調(diào)表達。Cpx雙組份系統(tǒng)可響應細菌對高滲信號的識別,激活后能夠抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系統(tǒng)可能在tolC缺失后影響ExPEC生物被膜形成中發(fā)揮作用。本研究通過對△tolC菌株中Cpx雙組份系統(tǒng)感應蛋白CpxA和效應蛋白CpxR進行突變,探究其在△tolC菌株影響生物被膜形成中的作用。主要研究內(nèi)容和結果如下:1.基因缺失菌株的構建設計引物以ExEPC PPECC42基因組為模板擴增cpxA上下游同源臂,并通過Overlap PCR方法連接,將同源臂插入自殺性載體pRE112,轉(zhuǎn)化大腸桿菌χ7213感受態(tài)細胞構建χ7213-pRE-△cpxA。并以此為供體菌,分別以ExEPC PPECC42野生株及△tolC株為受體菌進行同源重組,利用Cm和SacB篩選得到△cpxA基因缺失株和△tolC△cpxA雙基因缺失株。利用同樣方法,構建△cpxR基因缺失株和△tolC△cpxR雙基因缺失株。2.回補菌株和CpxA磷酸化位點定點突變菌株的構建以PPECC42基因組為模板,設計引物擴增cpxA基因全長,并插入pHSG396質(zhì)粒,構建pHSG-cpxA表達載體,電轉(zhuǎn)化至△tolC△cpxA菌株中,構建回補菌株CmA-△tolC△cpxA。運用同樣的方法構建出Cm-R-△tolC△cpxR。通過預測和翻譯分析,找出CpxA磷酸化位點對應的核酸序列位點,設計點突變引物以pHSG-cpxA質(zhì)粒為模板擴增出突變的質(zhì)粒,測序鑒定后電轉(zhuǎn)化△tolC△cpxA菌株中,以構建CpxA磷酸化位點突變菌株M-A-△tolC△cpxA。3.實驗菌株的部分生物學特性研究首先測定試驗菌株的生長情況,在M9和1/2M9培養(yǎng)基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失對ExPEC的生長速率無影響,試驗菌株在8h后可以達到穩(wěn)定期。其次使用7種抗菌藥測定了試驗菌株的MIC,結果表明△tolC和△tolC△cpxA、△tolC△cpxR菌株對氯霉素和環(huán)丙沙星的敏感性顯著升高,而cpxA和cpxR單缺失對這7種抗菌藥的敏感性并未發(fā)生明顯變化。4.試驗菌株生物被膜形成能力分析使用結晶紫染色法測定試驗菌株生物被膜形成能力,發(fā)現(xiàn)在M9高滲培養(yǎng)基中與WT相比△tolC菌株生物被膜形成能力顯著下降;雙基因缺失株△tolC△cpxA、△tolC△cpxR與WT相當;回補菌株Cm-A-△tolC△cpxA和Cm-R-△tolC△cpxR生物被膜形成能力恢復到△tolC的水平;M-A-△tolC△cpxA生物被膜形成能力與WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培養(yǎng)基中均無差異。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培養(yǎng)基中試驗菌株的生物被膜形成能力與M9中類似。5.掃描電子顯微鏡觀察生物被膜細菌微觀形態(tài)使用掃描電鏡觀察試驗菌株生物被膜細菌微觀形態(tài)發(fā)現(xiàn)在1/2M9+0.06 mol/L NaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高滲培養(yǎng)基中△tolC△cpxA、△tolC△cpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈現(xiàn)與WT相似大量黏附于玻片表面,且菌體之間存在大量黏連,但△tolC菌株在玻片上黏附較少,細菌菌體之間黏連情況也較少。6.Curli菌毛合成能力分析剛果紅平板試驗表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培養(yǎng)基中,△cpxA和△cpxR單基因缺失突變株和△tolC△cpxA、△tolC△cpxR雙基因缺失株能夠形成與野生型菌株WT類似的rdar菌落形態(tài),而Cm-A-△tolC△cpxA、Cm-R-△tolC△cpxR的菌落形態(tài)與△tolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA則可以形成與WT類似的菌落。在1/2M9-CR平板上試驗菌株的菌落形態(tài)均與WT相似。這表明Cpx雙組份系統(tǒng)確實在高滲條件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的過程中發(fā)揮了作用,而且是通過抑制Curli菌毛合成而影響的。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

2. 材料與方法2.1. 材料2.1.1. 菌株與載體大腸桿菌 PPECC42 野生株，血清型 O11，屬于 B2 群菌株，分離自湖南華豬肺臟，分離時間 2006 年 7 月，小鼠毒力試驗表明為強毒力菌株，基因組全序經(jīng)測定（GeneBank ID: NZ_CM003707.1），由本實驗室分離保存。大腸桿菌 DH5α，χ7213 由本實驗室保存。互補質(zhì)粒 pHSG396 均購自 Takara本）有限公司，其限制性圖譜見圖 2-1；自殺性載體 pRE112 由病毒室保存，其性圖譜見圖 2-2，本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒見表 2-1。

2. 材料與方法2.1. 材料2.1.1. 菌株與載體大腸桿菌 PPECC42 野生株，血清型 O11，屬于 B2 群菌株，分離自湖南華豬肺臟，分離時間 2006 年 7 月，小鼠毒力試驗表明為強毒力菌株，基因組全序經(jīng)測定（GeneBank ID: NZ_CM003707.1），由本實驗室分離保存。大腸桿菌 DH5α，χ7213 由本實驗室保存�；パa質(zhì)粒 pHSG396 均購自 Takara本）有限公司，其限制性圖譜見圖 2-1；自殺性載體 pRE112 由病毒室保存，其性圖譜見圖 2-2，本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒見表 2-1。

圖 2-3 cpxA 基因上下游同源臂重疊示意圖Fig 2-3 cpxA gene upstream and downstream homology arm splicing by overlap extension PC2.2.6.4. 重組自殺性質(zhì)粒 pRE-△cpxA 的構建將上步回收 PCR 產(chǎn)物和提取的 pRE112 質(zhì)粒使用 SacⅠ 和 KpnⅠ進行雙酶切，酶切 3h，之后使用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收片段，然后使用 T4DNA 連接酶 片段與載體進行連接，條件為16℃連接10-12h。酶切反應體系和連接反應體系如酶切體系：PCR 回收產(chǎn)物或載體 10μLKpnΙ 1μLSacΙ 1μLBuffer 2μLddH2O 6μL連接體系：酶切目的基因ΔcpxA 回收產(chǎn)物 6μL酶切載體 pRE112 回收產(chǎn)物 2μL

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本文編號：2808167