【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一種嚴重危害畜牧業(yè)生產的烈性傳染病。2010年2月和2011年3月,O型緬甸98(Mya98)系和“新一輪”泛亞(PanAsia-1)系傳入我國后迅速擴散,對我國養(yǎng)殖業(yè)和農村經濟發(fā)展造成了巨大影響。我國防控FMD采取免疫與撲殺相結合的綜合措施,免費對所用家畜進行滅活疫苗強制免疫,但因FMDV本身免疫原性弱,免疫持續(xù)期短,存在生物安全隱患,不利于FMD的凈化等因素的限制,使得FMD防控工作很難開展。因此,更多的學者將目光投入了FMD基因工程疫苗的研究。本研究是將實驗室構建的豬O型FMD基因工程菌進行工業(yè)化放大的生產工藝研究,通過檢驗對各個工藝流程進行效果評價,建立一套成熟、穩(wěn)定的豬FMD O型復合表位蛋白疫苗的生產工藝流程。將保存菌種進行形態(tài)、酶切、目的蛋白表達及Western blot鑒定。分別從誘導條件、培養(yǎng)基、接種量、pH、補料方式等因素進行優(yōu)化,使單位體積內培養(yǎng)液獲得最大菌體數(shù)量。采用濁度法測量發(fā)酵液的光密度,計算菌體重量,來分析各個優(yōu)化參數(shù)的效果。結果顯示:發(fā)酵培養(yǎng)最適培養(yǎng)時間為8h,誘導時間為8h,誘導溫度為37℃;培養(yǎng)基中最適磷酸鹽濃度為100mmol/L,微量元素溶液為1mL/L;最適接種量為5%,pH為7.0~7.2,裝液量30%;采用變指數(shù)-恒pH混合流加補料,補料液為氨水、甘油,其中甘油較葡萄糖更利于目的產物的獲得。采用中空纖維系統(tǒng)對菌體進行收集,高壓均質機不同壓力對菌體進行破碎,對比破碎效果,將收集的包涵體通過裂解進行了親和層析純化,用不同濃度的咪唑進行洗脫,確定最佳的咪唑洗脫濃度為100 mM。分別選取不同溫度、不同稀釋速度對收集的純化蛋白進行復性,通過檢驗復性后蛋白質的活性、濃度,確定最佳復性條件。最后進行過濾除菌分裝。將獲得的抗原樣品進行無菌檢驗,通過BCA法檢驗蛋白濃度約為1 mg/mL,通過凝膠法檢驗蛋白內毒素含量小于50 EU/mL,利用間接血凝法檢驗蛋白活性為1:1024,表達產物經SDS-PAGE分析蛋白分子量為25.5ku,采用Image Lab軟件分析蛋白純度90%以上,Western Blot方法檢測結果顯示,轉移至硝酸纖維素膜上與牛FMDV陽性血清反應,具有良好的反應性。參照現(xiàn)有口蹄疫滅活疫苗乳化工藝,選用ISA 206和ISA 201 VG油佐劑,分別用4.6:5.4、1:1、5.4:4.6的水相和油相比例進行乳化,制備疫苗。于2~8℃保存15個月,分別于第3、6、9、12、15個月取樣,進行疫苗物理性狀檢驗,并進行效力對比。結果顯示:疫苗水相和油相最佳配制比例為1:1。疫苗的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度均符合產品的質量要求,兩種油佐劑制備的乳劑均能誘導免疫豬產生1:64以上的抗體,ISA 201 VG佐劑疫苗免疫豬產生抗體水平高于ISA 206油佐劑,ISA 201 VG佐劑各免疫劑量組均獲得全保護。
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S859.53
【圖文】：

甘肅農業(yè)大學 2018 博士學位論文 第一章 口蹄疫基因工程疫苗研究進展廣。隨著工藝技術的要求，切向流過濾 (TFF) 系統(tǒng)目前正在進入生產工藝。對于會快速堵塞死端過濾儀器的分離液體來說，切向流過濾是一種有效的解決方法。使用切向流過濾時，大多數(shù)處理液會順著膜表面流動，而不是通過膜結構。液體會以與膜表面平行的相對較高的速度被泵送出。除了水處理應用外，順著膜表面的切向流只有一小部分會被滲透。比如，在多數(shù)細胞和顆粒分離中，只有 1%~5% 進樣到膜設備的流量會成為滲透液，剩下的 95%~99% 會退出膜設備成為“保留”。保留液會再循環(huán)至處理容器和組件入口，其中的 1%~5%會再作為滲透液被移除。再循環(huán)處理以快速連續(xù)的方式進行，產生一個顯著、持續(xù)的滲透率 (見圖 1-1)。

傳統(tǒng)過濾

結果.1 BL21-FMDV-B4 的鑒定.1.1 BL21-FMDV-B4 形態(tài)鑒定菌種 BL21-FMDV-B4 檢驗結果，菌落形態(tài)（圖 2-2A）、革蘭氏染色細菌態(tài)（圖 2-2B）均符合規(guī)定。圖 2-1 菌體干重與細菌密度關系的標準曲線Fig. 2-1 The standard curve of the relationship between the dryweight of the mycelium and the density of bacteria

【參考文獻】

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本文編號：2802357