【摘要】：遼寧絨山羊在絨毛品質(zhì)和產(chǎn)絨量方面,居世界同類品種前列,所產(chǎn)羊絨屬于稀有的特種動(dòng)物纖維,是一種珍貴的紡織原料。近日國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的國(guó)內(nèi)羊絨及山羊數(shù)據(jù)顯示,國(guó)內(nèi)原絨產(chǎn)量自2014年開(kāi)始逐年下降,且跌幅較大,自產(chǎn)的羊絨原料遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了本土企業(yè)和外商投資企業(yè)的生產(chǎn)和出口需要。而毛囊作為被毛生長(zhǎng)發(fā)育的重要部位,無(wú)論在胚胎期還是出生后,均具有自我更新和周期性生長(zhǎng)的特點(diǎn),且整個(gè)過(guò)程多基因參與。因此,通過(guò)對(duì)調(diào)控毛囊發(fā)育周期機(jī)理的研究來(lái)改善和提高羊絨的品質(zhì)和產(chǎn)量成為近年來(lái)的研究目標(biāo)。miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性的單鏈非編碼小RNA,通過(guò)與靶基因mRNA的非編碼區(qū)的結(jié)合抑制其翻譯或引起降解,從而參與生物體的生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)絨山羊和細(xì)毛羊毛囊周期發(fā)育中的miRNA開(kāi)展了系統(tǒng)的研究,通過(guò)高通量測(cè)序手段,發(fā)現(xiàn)作為上皮組織特異性表達(dá)的miRNA-203,參與絨山羊和細(xì)毛羊毛囊的發(fā)育,但其如何在毛囊周期發(fā)育中起調(diào)控作用的未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此,miRNA-203被選為本實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)。利用miRBase、microRNA.org、TargetScanHuman7.1和microRNA target prediction等在線生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA-203的靶基因,并篩選出與毛囊發(fā)育相關(guān)的靶基因,在mRNA水平、蛋白水平和細(xì)胞水平上,驗(yàn)證miRNA-203和候選靶基因在絨山羊毛囊周期發(fā)育中的表達(dá)差異,明確miRNA-203與靶基因的結(jié)合位點(diǎn),闡明miRNA-203對(duì)絨山羊毛囊發(fā)育周期的調(diào)控機(jī)理,完善miRNA在毛囊發(fā)育周期中的作用,為,提高和改善絨山羊羊絨產(chǎn)量和毛品質(zhì)提供了新的思路。具體研究結(jié)果如下:1.利用在線生物信息學(xué)軟件miRBase、microRNA.org、TargetScanHuman7.1和microRNA target prediction等預(yù)測(cè)miRNA-203的靶基因,并篩選出與毛囊發(fā)育相關(guān)的靶基因:DDOST、NAE1和GLYATL2。2.同源性分析,對(duì)DDOST、NAE1和GLYATL2測(cè)序表明與綿羊、牛等物種的同源性高達(dá)95%以上,說(shuō)明靶基因序列具有遺傳保守性。3.在mRNA水平上,對(duì)miRNA-203及DDOST、NAE1和GLYATL2進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn),miRNA-203在絨山羊毛囊發(fā)育的生長(zhǎng)期和休止期均有表達(dá),且在休止期的表達(dá)量顯著高于生長(zhǎng)期;候選靶基因的表達(dá)則相反。-4.對(duì)靶基因DDOST和NAE1進(jìn)行蛋白鑒定,結(jié)果表明,DDOST和NAE1在絨山羊生長(zhǎng)期中表達(dá)上調(diào),結(jié)果與熒光定量結(jié)果一致。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步表明miRNA-203通過(guò)DDOST和NAE1參與絨山羊毛囊周期發(fā)育。5.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定miRNA-203與靶基因DDOST和NAE1的特異性結(jié)合位點(diǎn)表明,在DDOST和NAE1的3’UTR上存在miRNA-203的靶位點(diǎn)—GAACCAC、GGCGTCC。6.通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在mRNA水平和蛋白水平上,對(duì)過(guò)表達(dá)miRNA-203后的miRNA-203及DDOST和NAE1進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,miRNA-203在mimics組的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組,而靶基因的表達(dá)則相反,miRNA-203顯著下調(diào)DDOST和NAE1的表達(dá)。綜上,miRNA-203通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因(DDOST和NAE1)參與毛囊周期發(fā)育,可作為一種進(jìn)一步選育優(yōu)質(zhì)羊品種的方法手段。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S827.2
【圖文】：

要的附屬可再生器官，是毛纖維的 發(fā)源地質(zhì)細(xì)胞各成分相互作用的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程[1、皮脂腺（SG）、隆突部（Bu）和毛球（HB）質(zhì)、毛皮質(zhì)和毛小皮組成[4]，內(nèi)根鞘（IRS）和的形成是毛囊形態(tài)發(fā)生最重要的一步，這也外根鞘位于內(nèi)根鞘的外層，被結(jié)締組織鞘包裹號(hào)通路直接或間接影響毛干的生長(zhǎng)發(fā)育[5]，毛干是上皮細(xì)胞和毛母質(zhì)細(xì)胞受真皮乳頭傳毛根和毛干的形成提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，毛球包圍lla cells, DPCs)是位于毛囊基底部的真皮源性主導(dǎo)作用，被視為毛囊發(fā)育調(diào)控中樞[9]。引乳頭細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能異常，已成為研究毛囊

濃度(ng/μl) OD260/230OD260/280休止期 濃度(ng/μl) OD260/230O452.76 1.847 2.015 1 513.16 1.577 2.583.00 1.584 1.963 2 475.88 1.578 2.717.09 1.772 1.979 3 511.92 1.592 1.401.24 1.849 2.003 4 410.64 1.628 1.517.00 1.576 1.986 5 350.44 1.713 1.538.68 1.645 2.008 6 556.92 1.517 2.定量 PCR 檢測(cè) miRNA-203 在生長(zhǎng)期和休止期絨山羊皮膚組織中驗(yàn)利用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)miRNA-203在絨山羊生長(zhǎng)期和休平。并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明：miRNA-203 在絨山羊期的皮膚組織中均有表達(dá)，且在休止期的表達(dá)量高于生長(zhǎng)期，差異.1，**P<0.01）。

miRNA-203NXPH4、B3GNT5、CNTNAP2、NOX4、LRTOMT、Wnt4、SLC7a6os、AKTN1、NAE1、JPH3、CCDC7、ITGA2、HSPB8、FOXP1 、 ATG12 、 DDOST 、 BAT2 、CD8B、GLYATL2、ILRB2、MANBAL、P2RX73.2 靶基因序列分析3.2.1 靶基因測(cè)序結(jié)果靶基因 PCR 的產(chǎn)物送庫(kù)美生物公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如圖 2.1 所示：去除前幾個(gè)不穩(wěn)定的堿基外，峰值表現(xiàn)單一，送檢樣品純度較高。同時(shí)結(jié)果也顯示，GLYATL2、DDOST 和 NAE1 片段大小分別為 204 bp、270 bp、176 bp，與設(shè)計(jì)的片段大小基本一致，表明測(cè)序正確。

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本文編號(hào)：2793628