【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染哺乳動物中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)的傳染性疾病�？袢∈侨诵蠊不疾�,病死率極高,一旦出現臨床癥狀,死亡率高達100%。據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球范圍內每年有超過5萬人死于狂犬病,但絕大多數病例發(fā)生在亞洲和非洲等發(fā)展中國家。狂犬病病毒可以感染幾乎所有的溫血動物,野生動物是其主要的儲存宿主,人和各種哺乳動物為傳播宿主。帶毒動物唾液中具有感染性的病毒粒子經抓咬撓傷造成宿主皮膚或粘膜受損隨后侵入機體,對CNS侵染隨后發(fā)病死亡。長鏈非編碼RNA(Long-chain noncoding RNA,lncRNA)是一種長度大于200 nt,缺乏閱讀框且不編碼蛋白質的RNA分子,它在細胞核和細胞質中均有分布。lncRNA雖然不編碼蛋白質,但卻參與DNA甲基化、轉錄激活調控并干擾、細胞核內運輸翻譯等重要調控過程。lncRNA可通過轉錄和轉錄后水平調控基因表達的調控以及對基因進行表觀遺傳學修飾。機體抗RABV感染主要依靠固有免疫,尤其是I型干擾素反應。病毒感染后,體內細胞表面受體和胞內受體可識別相關模式分子,激活信號通路并誘導細胞分泌I型干擾素。越來越多的證據表明,lncRNA在宿主抗病毒反應、固有免疫中起重要的調節(jié)作用。然而,對RABV誘導宿主免疫應答中的lncRNA的表達譜和功能尚不清楚。因此闡述RABV感染誘導的lncRNA表達譜變化對深入探索RABV的致病機制及其防治策略具有重要意義。本實驗在細胞水平和小鼠腦組織水平上通過小RNA測序分析RABV感染中l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜。首先利用SRV9和CVS11兩種病毒分別感染BHK21細胞,感染12 h,24 h,48 h后提取總RNA,構建文庫,測序分析lncRNA和mRNA的表達譜。結果顯示,與未感染組相比感染CVS11組有940個lncRNA出現差異表達,而感染SRV9組有946個lncRNA出現差異表達。在感染BHK21細胞的mRNA表達譜中,與未感染組相比感染SRV9病毒組有5984個mRNA出現差異表達,感染CVS11病毒組有5674個mRNA出現差異表達(P0.05)。GO富集分析顯示,在CVS11組感染48 h后,觀察到lncRNA的靶基因對細胞應答、髓樣樹突細胞活化、巨噬細胞因子產生的調節(jié)和趨化因子受體活性的正調節(jié)顯著富集,而在SRV9組感染48 h后,lncRNA的靶基因對信號轉導,蛋白激酶和胚胎形態(tài)發(fā)生的調節(jié)顯著富集。KEGG富集分析結果顯示CVS11組感染48 h后,lncRNA靶基因有16個KEGG通路顯著富集,其中包括涉及免疫應答的途徑、病毒致癌作用、FoxO信號通路和MAPK信號通路等;在SRV9感染組中也觀察到類似的結果。這些發(fā)現表明lncRNA在RABV感染期間調節(jié)免疫反應,通過調節(jié)其鄰近的蛋白質編碼基因來對病毒感染作出反應。本研究選取了差異表達lncRNA和mRNA進行了RT-qPCR驗證。其次利用CVS11狂犬毒株感染小鼠腦組織,在感染第八天發(fā)病時取小鼠腦組織,提取總RNA,構建文庫,測序分析lncRNA和mRNA的表達譜。結果表明,與未感染組相比CVS11感染組共有140個lncRNA差異表達。染色體7號,12號和16號的lncRNA差異變化最大;染色體18號,19號和染色體X的lncRNA差異變化最小。同時我們檢測了CVS11毒株感染小鼠腦組織后mRNA的表達譜變化,結果表明,與未感染小鼠相比CVS11感染組有3807個lncRNA差異表達基因(FC≥2,P0.05)。染色體2號,7號和11號mRNA差異表達最顯著,染色體16號和18號mRNA差異較為顯著。GO分析表明lncRNA上游或下游100 kb的位置同位基因編碼蛋白高度富集。差異表達的lncRNA共定位的基因高度富集在如氮化合物的解毒、氮化合物的細胞解毒和硝基苯的代謝過程等生物過程中。KEGG分析結果顯示,差異表達的lncRNA靶點參與Toll樣受體、NF-κB、MAPK、趨化因子、單純皰疹和流感A感染等重要信號通路。這些發(fā)現表明lncRNA在RABV感染期間參與調節(jié)免疫反應。隨后進行實時定量PCR驗證差異表達,結果顯示與小RNA測序分析RABV感染后差異表達一致。本研究通過RABV感染細胞和小鼠,分別在體外和體內水平分析lncRNA和mRNA表達譜變化,并選擇差異表達lncRNA和mRNA進行RT-qPCR驗證�；谏飳W信息分析,在體外和體內水平初步明確RABV感染誘導宿主的免疫應答路徑。目前,尚未見RABV感染宿主lncRNA表達譜變化的研究。本研究為闡述RABV的免疫逃逸機制和致病機理提供數據支持。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

東北農業(yè)大學農學碩士學位論文 概述V 病原學特征于彈狀病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病毒屬(lyssavirus)的單股復 75~80 nm，長 175~200 nm，會隨不同毒株發(fā)生變化[5, 6]。病毒形形，另一端平坦或略凹的典型特征。內層為核殼，內部為核心，狀凸起，凸起物遠端為槌狀。螺旋對稱的核衣殼由單股 RNA 和整個病毒表面呈蜂窩狀的六角形結構[8]。RABV 可以在多種細胞動物模型例如鼠腦內接種來獲取高濃度的病毒，RABV 能耐受低6oC 時 15~30 min 或 100oC 時 2 min 即可滅活。強酸堿、紫外線波均可殺滅病毒，0.01% 碘液和 1%~2% 的肥皂水等亦能使病毒下可長期保存。對常規(guī)有機溶劑敏感，一般抗生素對狂犬病病毒

圖 1-2 狂犬病病毒結構蛋白示意圖[15]Figure 1-2 Schematic representation of rabies virus structural protein[15]RABV 與宿主免疫應答毒侵入機體后，首先會誘導機體產生抗病毒作用的免疫應答過程，包括先天性免疫免疫反應。先天性免疫首先幫助宿主抵抗病毒感染，它包括干擾素(interferon, IFN)胞吞噬功能的增強、炎癥反應的產生等。經感染后，IFN 介導的信號通路和細胞轉所參與的基因上調，例如干擾素信號通路基因和干擾素調節(jié)因子等[16]。隨著先天性表達的提高，病毒可引起炎性細胞在中樞神經系統(tǒng)浸潤可并造成強烈炎癥反應。隨毒致病性的免疫反應，但隨著神經細胞的損壞，同時也會伴隨著一些病理變化的出現RABV 的 N 蛋白的超抗原作用能激活 T 淋巴細胞并刺激機體對無關抗原產生免疫反應夠加重炎癥反應，還能誘導自身免疫腦脊髓炎的產生[17, 18]。因此，在產生過度免疫況下，經免疫反應介導而導致嚴重損傷 CNS 組織，引起免疫反應導致機體死亡[1, 19lncRNA 概述 lncRNA 生物學特征及分類

mRNA）；縱坐標表達水平。ncRNA, mRNA); ordinate expression level.圖 3-9 FPKM 法分析 ncRNA 基因和 mRNA 基因表達水alysis of lncRNA gene and mRNA expression level by AF蛋白質的 RNA 相比，lncRNA 在轉錄本長度和 ORFs 中A 和 lncRNA 之間的外顯子數目的顯著差異，大多數 數 mRNA 含有多達 20 個外顯子。大多數 mRNA 的 ORB C

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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相關碩士學位論文 前1條

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本文編號：2783557