【摘要】：microRNA(縮寫為miRNA)是長度約為22個核苷酸的單鏈小分子RNA,能夠與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合位點互補結(jié)合,從而抑制靶基因的表達。研究表明miR-124能夠調(diào)控多種基因的表達,具有細胞分化、細胞增殖等作用,并參與綿羊脂肪形成與沉積、豬脂肪細胞分化等生物學(xué)過程。脂的合成和代謝是重要的生理過程,但在奶牛中miR-124調(diào)控乳脂代謝過程的研究還很有限。因此,本研究旨在對bta-miR-124a(奶牛miR-124a)與乳脂代謝相關(guān)的靶基因進行鑒定,并驗證其生物學(xué)功能。為深入研究miR-124調(diào)控脂代謝的分子機制提供依據(jù),從而為具有優(yōu)質(zhì)乳品質(zhì)性狀奶牛新品系的分子育種研究提供重要的試驗支撐。前期課題組通過高通量測序得到高脂及低脂奶牛乳腺上皮細胞miRNA表達譜,從差異極顯著表達的miRNA中,選擇bta-miR-124a作為研究對象,并利用奶牛乳腺上皮細胞為試驗材料,對bta-miR-124a靶基因及其生物學(xué)功能進行驗證。首先,采用生物信息學(xué)方法分析bta-miR-124a成熟區(qū)序列保守性,并對其候選靶基因進行預(yù)測,同時對bta-miR-124a候選靶基因信號通路進行深入分析。結(jié)果表明,bta-miR-124a的成熟序列在各物種間具有高度的保守性,預(yù)測得到TargetScan和miRWalk數(shù)據(jù)庫交集候選靶基因57個,其候選靶基因能夠參與癌癥發(fā)生、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)、AMPK(單磷酸腺苷活化蛋白激酶,AMP-activated protein)、cAMP(環(huán)磷酸腺苷,Cyclic adenosine monophosphate)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝及脂肪酸合成等多種重要的細胞調(diào)控通路。其中,與脂代謝相關(guān)的候選靶基因有PECR(過氧化物酶體反式-2-烯酰輔酶A還原酶,peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase)、SCD(硬脂酰輔酶A去飽和酶,stearoyl-CoA desaturase)、ELOVL5(脂肪酸延長酶5,fatty acid elongase 5)、CPT1A(肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A,carnitine palmitoyl transferase 1A)等。本研究選擇PECR基因做進一步靶基因鑒定及功能驗證,方法主要采用的是雙熒光素酶報告基因和實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)研究了進一步鑒定bta-miR-124a與靶基因的靶向關(guān)系。結(jié)果表明:過表達bta-miR-124a組細胞中PECR基因表達量和蛋白表達顯著低于對照組(p0.05),抑制bta-miR-124a組細胞中PECR基因表達量和蛋白表達顯著高于對照組(p0.05)。此外,轉(zhuǎn)染bta-miR-124a mimics、bta-miR-124a inhibitor組后PECR下游基因ELOVL2(脂肪酸延長酶2,fatty acid elongase 2)表達量、細胞中總甘油三酯和游離脂肪酸含量也做了進一步的檢測。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染bta-miR-124a過表達組中,bta-miR-124a能夠顯著正調(diào)控PECR下游基因ELOVL2(p0.05)的表達量以及甘油三酯(p0.01)和游離脂肪酸(p0.05)的含量。與對照組相比,轉(zhuǎn)染bta-miR-124a抑制劑后bta-miR-124a能夠顯著負調(diào)控ELOVL2的表達量(p0.01)。而甘油三酯的表達量高于對照組以及游離脂肪酸含量低于對照組,均未見顯著性差異。以上結(jié)果得出結(jié)論:(1)bta-miR-124與PECR基因通過生物信息學(xué)分析、熒光定量PCR及雙熒光素酶驗證得到具有靶向關(guān)系,PECR為bta-miR-124a的靶基因。(2)bta-miR-124a能夠在脂代謝通路中,調(diào)控PECR下游基因ELOVL2的表達量。(3)bta-miR-124a能有效地影響奶牛乳腺上皮細胞中的甘油三酯和游離脂肪酸含量,從而參與調(diào)控乳汁的合成和分泌。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

圖 1-2 PECR 基因相互作用的蛋白質(zhì)Fig1-2 Interacting Proteins for PECR gene（選自 https://www.genecards.org/）

圖 2-1 兩種軟件對 miR-124a 的候選靶基因預(yù)測get Gene prediction results of bta-miR-124a using two kinds 靶基因 GO 分析

圖 2-2 bta-miR-124a 候選靶基因的 GO 分子功能注釋分析Fig2-2 The GO molecular functional annotation of bta-miR-124apredicted candidate target genes

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