【摘要】：乳房炎是奶牛常見(jiàn)病,無(wú)乳鏈球菌(Streptococus agalactiae)是奶牛乳房炎的重要病原體之一。除了在乳腺組織中定植,無(wú)乳鏈球菌還可通過(guò)黏附入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs),宿主則會(huì)通過(guò)基因表達(dá)及程序性死亡來(lái)抵御細(xì)菌入侵。目前對(duì)于無(wú)乳鏈球菌黏附、入侵BMECs及宿主細(xì)胞抵御細(xì)菌入侵的機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是裂解性、炎性細(xì)胞死亡,主要由胞內(nèi)菌誘導(dǎo),是近年發(fā)現(xiàn)的生物體對(duì)抗病原體感染的新機(jī)制。無(wú)乳鏈球菌是否可以誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)酶消化法分離原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(primary BMECs,pBMECs),并以此細(xì)胞為模型,探究無(wú)乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞的機(jī)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡的情況。首先,本研究利用無(wú)乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞,通過(guò)激光共聚焦與胞內(nèi)菌落計(jì)數(shù)的方法來(lái)確定細(xì)菌入侵細(xì)胞;運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析并篩選出無(wú)乳鏈球菌入侵相關(guān)的差異表達(dá)蛋白,再進(jìn)行Western blot驗(yàn)證;采用胞內(nèi)菌落計(jì)數(shù)法及qPCR檢測(cè)細(xì)菌特異性基因的方法,分別檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞在LAMB2轉(zhuǎn)錄后沉默或LAMB2抗體封閉,整合素(Integrin)抑制劑(RGD)預(yù)處理,ITGAV轉(zhuǎn)錄后沉默,FAK小分子抑制劑(TAE226)預(yù)處理或FAK轉(zhuǎn)錄后沉默,Crk轉(zhuǎn)錄后沉默或過(guò)表達(dá),Vps25轉(zhuǎn)錄后沉默或過(guò)表達(dá)情況下,無(wú)乳鏈球菌入侵到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目;采用Western blot檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞在整合素抑制劑(RGD)預(yù)處理,FAK小分子抑制劑(TAE226)預(yù)處理或FAK轉(zhuǎn)錄后沉默,Crk轉(zhuǎn)錄后沉默,Vps25轉(zhuǎn)錄后沉默情況下,無(wú)乳鏈球菌入侵誘導(dǎo)的FAK表達(dá)及其磷酸化水平,Crk表達(dá)及其磷酸化水平,Vps25和RhoA表達(dá)水平的變化。通過(guò)Western blot,ELISA,掃描電鏡等方法探究無(wú)乳鏈球菌誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)無(wú)乳鏈球菌在不同MOI下侵染pBMECs 2 h,可以入侵到細(xì)胞內(nèi);2)無(wú)乳鏈球菌以MOI為100侵染pBMECs 2 h,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,做蛋白質(zhì)組檢測(cè)。通過(guò)比較蛋白質(zhì)組分析,與對(duì)照組相比,無(wú)乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞組共有169個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中37個(gè)蛋白可以被GO及KEGG注釋,包含16個(gè)上調(diào)蛋白和21個(gè)下調(diào)蛋白;3)結(jié)合本文研究目的和內(nèi)容選擇Crk、Vps25及RhoA用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致,無(wú)乳鏈球菌入侵導(dǎo)致Crk表達(dá)上調(diào),Vps25及RhoA的表達(dá)下調(diào);4)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白laminin基因(LAMB2)轉(zhuǎn)錄后沉默或抗體封閉LAMB2,會(huì)顯著抑制無(wú)乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.05),預(yù)示LAMB2介導(dǎo)細(xì)菌入侵;5)特異性抑制劑RGD預(yù)處理細(xì)胞抑制Integrin活性,或ITGAV轉(zhuǎn)錄后沉默減少Integrin表達(dá),顯著抑制無(wú)乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.05),預(yù)示Integrin介導(dǎo)細(xì)菌入侵;6)FAK特異性抑制劑TAE226預(yù)處理細(xì)胞抑制FAK活性,或FAK轉(zhuǎn)錄后沉默減少FAK表達(dá),顯著減少無(wú)乳鏈球菌入侵到乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.05),預(yù)示FAK介導(dǎo)細(xì)菌入侵;7)Crk轉(zhuǎn)錄后沉默顯著提高無(wú)乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.05),反之Crk過(guò)表達(dá)則顯著減少無(wú)乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.05),預(yù)示Crk具有抵御細(xì)菌入侵的作用;8)Vps25轉(zhuǎn)錄后沉默顯著提高無(wú)乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.05),反之Vps25過(guò)表達(dá)則顯著減少無(wú)乳鏈球菌入侵到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目(p㩳0.01),預(yù)示Vps25具有抵御細(xì)菌入侵的作用;9)無(wú)乳鏈球菌入侵促進(jìn)FAK磷酸化,抑制Crk磷酸化,抑制Vps25和RhoA表達(dá),預(yù)示細(xì)菌通過(guò)激活FAK抑制Crk活性,進(jìn)而抑制Vps25表達(dá),減弱細(xì)胞抵御細(xì)菌入侵的能力。同時(shí)細(xì)菌入侵抑制了RhoA表達(dá),預(yù)示可以促進(jìn)細(xì)胞骨架重排,有利于細(xì)菌內(nèi)化;10)Co-IP結(jié)果初步證明Crk與Vps25之間存在相互作用,二者可能協(xié)同抵御細(xì)菌入侵;11)無(wú)乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞24 h后,Caspas-1被激活,IL-1β及IL-18的分泌增加,細(xì)胞膜上形成小孔,表明無(wú)乳鏈球菌通過(guò)經(jīng)典途徑誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生焦亡�？傊�,無(wú)乳鏈球菌入侵乳腺上皮細(xì)胞,通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)laminin(LAMB2)結(jié)合實(shí)現(xiàn)黏附,通過(guò)整合素Integrin實(shí)現(xiàn)內(nèi)化。細(xì)菌入侵激活FAK,抑制Crk活性和Vps25表達(dá),同時(shí)使得RhoA表達(dá)降低,引起細(xì)胞骨架重排,細(xì)菌進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。在此過(guò)程中Crk與Vps25起到協(xié)同抵抗細(xì)菌入侵的作用,FAK的激活則有利于細(xì)菌入侵。無(wú)乳鏈球菌入侵誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞通過(guò)經(jīng)典途徑發(fā)生焦亡,以抵抗病原菌感染。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)為奶牛乳房炎的預(yù)防和治療提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23
【圖文】：

無(wú)乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞的機(jī)制研究Caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑。在經(jīng)典途徑中，病原體或者其相關(guān)毒力因子激活各自的性小體，包括NLRP1b、NLRP3、NLRC4、AIM2或Pyrin。NLRP3和NLRC4炎癥體的激活需激酶NEK7和NAIP3的配合[111-113]。炎癥小體傳感器觸發(fā)炎癥小體轉(zhuǎn)接器ASC招募Caspase-體，激活Caspase-1，使得Gasdermin D和pro- IL-1β、pro-IL-18被切割，而31kDa的Gasdermi的N端被切割后在細(xì)胞膜上打孔形成孔洞，使得胞內(nèi)的內(nèi)容物釋放，同時(shí)也將IL-1β和IL-1放到細(xì)胞外[114-121]。對(duì)于非經(jīng)典途徑，它是由來(lái)自胞內(nèi)的分離自革蘭氏陰性菌的LPS引起的在人的細(xì)胞中激活Caspase-4或者Caspase-5，在小鼠細(xì)胞中激活Caspase-11。這些被激活Cspase直接裂解Gasdermin D引起細(xì)胞焦亡。同時(shí)Gasdermin D裂解的N端也可以去激活NL這個(gè)炎性小體，進(jìn)而激活Caspase-1釋放IL-1β和IL-18[122-125]。目前這兩條途徑及其涉及到的性小體和Gasdermin家族是細(xì)胞焦亡的研究熱點(diǎn)。

圖2.1 iTRAQ四標(biāo)實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線g.2.1 iTRAQ four standard experimental technology roS-PAGE電泳檢測(cè)，F(xiàn)ASP酶解，LC-MS質(zhì)譜分白質(zhì)鑒定數(shù)量；并通過(guò)以下步驟：肽段iTR樣品間蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。和篩選行數(shù)據(jù)分析，RAW文件通過(guò)Proteome Disc 好 的 數(shù) 據(jù) 庫(kù) ， 再 利 用 軟 件 Masc6_20150414.fasta進(jìn)行查庫(kù)鑒定。采用Proteom強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。是選擇含量差異2倍以上的作為差異蛋白， Cluster軟件對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行注釋，基于

內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文36圖2.2 激光掃描共聚焦觀察S. agalactiae入侵pBMECs（200×）激光掃描共聚焦顯微鏡觀察S. agalactiae入侵pBMECs 2 h，MOI為100:1和未入侵，Alexa Fluor 594Phalloidin 鬼筆環(huán)肽染色肌動(dòng)蛋白(Actin)呈紅色；DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色；CFDA染色S. agalactiae呈綠色；Marged為疊加后圖像。Fig. 2.2 S. agalactiae invaded pBMECs by LSCM（200×）pBMECs were either uninvaded or invaded with S. agalactiae at MOI of 100 for 2 h，Alexa Fluor 594 Phalloidinstaining actin, red; DAPI staining nuclei, blue; CFDA staining S. agalactiae, green; Marged is a superimposedimage.3.2 無(wú)乳鏈球菌入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析與驗(yàn)證3.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的制備與分析由于比較蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)的要求，為了符合檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，保證數(shù)據(jù)的全面性與準(zhǔn)確性。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩組，正常pBMECs組（control），及S. agalactiae 以MOI為100:1入條件侵pBMECs 2 h，再用含有溶菌酶和抗生素的培養(yǎng)基細(xì)胞外殺菌2 h組。為了保證蛋白質(zhì)組檢測(cè)要求以及生物學(xué)重復(fù)要求

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本文編號(hào)：2774886