【摘要】：雞的心包積液綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和包涵體肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)均是由禽Ⅰ群腺病毒引起的急性傳染病。近年來(lái),這兩種疾病在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。禽Ⅰ群腺病毒分為A、B、C、D、E等5個(gè)基因型,按照血清型分為1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型;基因型和血清型的對(duì)應(yīng)關(guān)系為A(1)、B(5)、C(4、10)、D(2、3、9、11)、E(6、7、8a、8b)。當(dāng)前我國(guó)HHS和IBH的主要病原分別是禽Ⅰ群腺病毒血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)。因此,研制FAdV-4和FAdV-8b二價(jià)油乳劑滅活疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。1 FAdV-8b QD2016株的分離與鑒定本研究從山東某雞場(chǎng)疑似發(fā)生IBH的病例中分離到1株禽腺病毒(命名為QD2016株)。設(shè)計(jì)了 33對(duì)引物,對(duì)QD2016株全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)定和生物信息學(xué)分析。(QD2016株基因組全長(zhǎng)為43632bp,與禽Ⅰ群腺病毒E基因型CR119株、YR36株、TR59株、764株、HG株、UPM04217株、HLJ/151129株同屬一個(gè)大的進(jìn)化分支,核苷酸序列同源性介于93.4%～98.4%之間;QD2016株與UPM04217株親緣關(guān)系最近,同屬于FAdV-8b。2 FAdV-4和FAdV-8b二價(jià)油乳劑滅活疫苗的研制本研究以FAdV-8b QD2016株和實(shí)驗(yàn)室先前分離鑒定的FAdV-4 GX2013株研制二價(jià)油乳劑滅活疫苗。根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》的要求建立了兩個(gè)毒株的種子庫(kù),經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)禽白血病病毒(ALV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)等外源病毒的污染。利用細(xì)胞工廠培養(yǎng)LMH細(xì)胞,用于擴(kuò)增FAdV-4 GX2013株和FAdV-8b QD2016株。應(yīng)用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,對(duì)擴(kuò)增的病毒進(jìn)行定量分析;確定擴(kuò)增GX2013株和QD2016株的最佳感染復(fù)數(shù)分別為1.2和3.2,適宜的收毒時(shí)間均為接毒后72 h。病毒液經(jīng)終濃度為1‰的甲醛滅活,以白油為佐劑制成油乳劑滅活疫苗。研制的疫苗為油包水劑型,物理性狀穩(wěn)定,無(wú)菌檢驗(yàn)合格。取7日齡SPF雞20只,分為2組,每組10只。第1組為免疫組,于頸部皮下接種制備的滅活疫苗,0.5mL/只;第2組為對(duì)照組,于頸部皮下接種等劑量的滅菌白油。接種后21 d內(nèi)免疫組和對(duì)照組的雞精神狀況及采食量均正常,剖檢未發(fā)現(xiàn)接種部位出現(xiàn)損傷、炎癥及疫苗殘留等現(xiàn)象,表明該疫苗的安全性良好。將7日齡SPF雞分成6組,每組10只,分別免疫25 μL、50μL、100μL、250 μL和500μL疫苗,以及500μL滅菌白油(對(duì)照組)。免疫后21 d,每組各取5只雞,分別用FAdV-4GX2013 株(105.5 TCID50/mL)和 FAdV-8bQD2016 株(105.5TCID50/mL)經(jīng)肌肉注射進(jìn)行攻毒,0.2 mL/只;分別于攻毒后3 d、5 d、7 d和10 d采集試驗(yàn)雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子,應(yīng)用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定病毒含量。結(jié)果顯示,攻毒后7 d內(nèi)咽喉和泄殖腔排毒量相繼達(dá)到高峰,其中25μL、50 μL和100μL免疫組的排毒量與對(duì)照組相比差異不顯著(P0.5),250 μL和500 μL免疫組的排毒量與對(duì)照組相比差異極顯著(P0.01),而這兩個(gè)免疫組之間的排毒量差異不顯著(P0.5)。據(jù)此推測(cè):疫苗的免疫劑量為250 μL和500 μL/只均能有效阻止排毒,建議的疫苗免疫劑量為250 μpL/只。取7日齡SPF雞30只,分為3組,每組10只。第1組和第2組為免疫組,每只雞頸部皮下接種250 μL疫苗;第3組為對(duì)照組,每只雞頸部皮下接種250 μL滅菌白油。第1組的雞只于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采血分離血清,分別應(yīng)用血清中和試驗(yàn)(SNT)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGPT)監(jiān)測(cè)抗體消長(zhǎng)規(guī)律。第2組和第3組的雞只于免疫后21 d 各取 5 只,分別用 FAdV-4 GX2013 株(106.5 TCID50/mL)和 FAdV-8b QD2016 株(106.5 TCID50/mL)經(jīng)肌肉注射進(jìn)行攻毒,0.2mL/只;分別于攻毒后3d、5d、7d和10d采集試驗(yàn)雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子,應(yīng)用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定病毒含量。SNT結(jié)果顯示,在免疫后7d可檢測(cè)到FAdV-4和FAdV-8b血清中和抗體,免疫后21 d均達(dá)到峰值(210.7和210.6),以后逐漸下降,到免疫后35 d仍能保持較高水平(210.2和29.9);AGPT結(jié)果顯示,在免疫后14d可檢測(cè)到FAdV-4和FAdV-8b抗體,21d抗體陽(yáng)性率最高(100%和90%),隨后開(kāi)始緩慢下降,AGPT抗體增長(zhǎng)規(guī)律與血清中和抗體保持一致。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組的雞只在攻FAdV-4GX2013株后3d內(nèi)全部死亡,免疫組的雞只表現(xiàn)正常,臨床保護(hù)率達(dá)100%;對(duì)照組的雞只在攻FAdV-8bQD2016株后出現(xiàn)采食量下降、精神沉郁、拉稀等現(xiàn)象,免疫組的雞只表現(xiàn)正常,免疫組和對(duì)照組雞只的咽喉拭子和泄殖腔拭子中病毒含量差異極顯著(P0.01)。綜上所述,研制的二價(jià)油乳劑滅活疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

逡逑喔＿逡逑圖１．１邋ＬＭＨ細(xì)胞在不同時(shí)間的細(xì)胞病變逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅｓ逡逑２．２間接免疫熒光（ＩＦＡ）檢測(cè)逡逑利用本實(shí)驗(yàn)室保存的雞抗ＦＡｄＶ－８ｂ陽(yáng)性血清，對(duì)ＱＤ２０１６株利用間接免疫熒光進(jìn)行鑒逡逑定。如圖所示，接種ＱＤ２０１６株的ＬＭＨ細(xì)胞可見(jiàn)有明顯的綠色熒光（圖１．２Ａ），而未接逡逑種ＱＤ２０１６株的ＬＭＨ細(xì)胞檢測(cè)不到熒光（圖１．２邋Ｂ）。表明ＱＤ２０１６株屬于ＦＡｄＶ－８ｂ且能逡逑在雞肝癌細(xì)胞系（ＬＭＨ）上很好的增殖。邐逡逑圖１．２間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋．２邋Ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｉｎｄｉｒｅｃｔ邋ｉｍｍｕｎｏｆ

逑利用設(shè)計(jì)合成的３３對(duì)引物，對(duì)ＱＤ２０１６株全基因組進(jìn)行ＰＣＲ分片段擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果逡逑顯示各片段與預(yù)期的目的條帶大小一致（如圖１．３、圖１．４）。將各片段分別克隆測(cè)序后經(jīng)拼逡逑接獲得了邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株的全基因組序列。逡逑Ｍｌ邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７逡逑｜：‘：賀逡逑ＡＢＢＢ逡逑圖１．３ＰＣＲ分段擴(kuò)增全基因電泳圖（１￣１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１？１７）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１？１７分別為前１７對(duì)引物擴(kuò)增片段逡逑ｉｍ逡逑圖１．４邋ＰＣＲ分段擴(kuò)增全基因電泳圖（１８？３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１８－３３）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１８？３３：分別為后１６對(duì)引物擴(kuò)增片段逡逑２．４邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株全基因組序列的分析逡逑２．４．１邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株基因組的分析逡逑用ＤＮＡＳｔａｒ軟件包對(duì)獲得的ＱＤ２０１６株全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明：逡逑ＱＤ２０１６邋株全長(zhǎng)邋４３６３２邋ｂｐ，Ｇ＋Ｃ邋含量為邋５７．８％。參照邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＵＰＭ０４２１７邋株對(duì)其邋ＯＲＦ邋的位逡逑置以及編碼的蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)（見(jiàn)表１．２）

逑利用設(shè)計(jì)合成的３３對(duì)引物，對(duì)ＱＤ２０１６株全基因組進(jìn)行ＰＣＲ分片段擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果逡逑顯示各片段與預(yù)期的目的條帶大小一致（如圖１．３、圖１．４）。將各片段分別克隆測(cè)序后經(jīng)拼逡逑接獲得了邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株的全基因組序列。逡逑Ｍｌ邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７逡逑｜：‘：賀逡逑ＡＢＢＢ逡逑圖１．３ＰＣＲ分段擴(kuò)增全基因電泳圖（１￣１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１？１７）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１？１７分別為前１７對(duì)引物擴(kuò)增片段逡逑ｉｍ逡逑圖１．４邋ＰＣＲ分段擴(kuò)增全基因電泳圖（１８？３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１８－３３）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１８？３３：分別為后１６對(duì)引物擴(kuò)增片段逡逑２．４邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株全基因組序列的分析逡逑２．４．１邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株基因組的分析逡逑用ＤＮＡＳｔａｒ軟件包對(duì)獲得的ＱＤ２０１６株全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明：逡逑ＱＤ２０１６邋株全長(zhǎng)邋４３６３２邋ｂｐ，Ｇ＋Ｃ邋含量為邋５７．８％。參照邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＵＰＭ０４２１７邋株對(duì)其邋ＯＲＦ邋的位逡逑置以及編碼的蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)（見(jiàn)表１．２）

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本文編號(hào)：2774880