發(fā)布時間：2020-07-23 18:55

【摘要】：羊傳染性膿皰病是由傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)感染引起以綿羊、山羊為主的一種急性、高度接觸性傳染病。以在患羊口唇等部位的皮膚或黏膜形成紅斑、膿皰等病變?yōu)橹饕卣鳌Ｍ瑫r,它也是一種重要的人獸共患病。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),宿主因子親環(huán)蛋白B(Cyclophilin B,Cyp B)能夠促進(jìn)ORFV的復(fù)制增殖。然而,Cyp B在ORFV侵染過程中發(fā)揮怎樣的生物學(xué)功能,而ORFV又是如何利用Cyp B促進(jìn)其復(fù)制增殖并完成侵染的過程尚不明確。因此,本研究對Cyp B在ORFV侵染過程中潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行探討分析,并利用免疫共沉淀技術(shù)對與Cyp B互作的病毒蛋白或蛋白質(zhì)分子群進(jìn)行篩選。為明確Cyp B在ORFV侵染過程中潛在的生物學(xué)功能,首先利用激光共聚焦顯微鏡對Cyp B在感染前后宿主細(xì)胞中的定位分布情況進(jìn)行檢測;同時制作細(xì)胞超薄切片,利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化以及Cyp B蛋白的定位分布,結(jié)果顯示,Cyp B主要分布在MDBK細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。之后,應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針ER-Tracker Red進(jìn)行熒光標(biāo)記,利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察Cyp B在亞細(xì)胞水平上的定位分布,結(jié)果顯示,在ORFV感染的宿主細(xì)胞中,Cyp B與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在明顯的共定位現(xiàn)象,該結(jié)果進(jìn)一步證實Cyp B主要定位分布于MDBK細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。利用特異性抑制劑環(huán)孢菌素A(Cs A)改變Cyp B的順反異構(gòu)酶活性,探討其活性改變對ORFV感染宿主細(xì)胞能力的影響。利用Western-blot檢測在ORFV早期感染MDBK細(xì)胞中加入不同濃度Cs A對Cyp B表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,隨著Cs A濃度的增加,Cyp B的表達(dá)量逐漸下降,該結(jié)果表明Cs A能夠抑制Cyp B的表達(dá)。利用Real-time PCR檢測加入不同濃度Cs A對病毒復(fù)制的影響,結(jié)果顯示,在低劑量藥物濃度范圍內(nèi),Cs A不僅能夠抑制Cyp B的表達(dá),而且同時抑制ORFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制增殖。上述結(jié)果進(jìn)一步證實Cyp B是ORFV侵染過程中的重要輔助因子,能夠促進(jìn)ORFV復(fù)制。然而,ORFV是如何利用Cyp B促進(jìn)其復(fù)制增殖并完成侵染的過程尚不清楚。因此,本研究利用免疫共沉淀技術(shù)篩選與Cyp B互作的蛋白。免疫共沉淀產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot的分析結(jié)果顯示,在大小約為25 k D處可見有明顯的差異條帶。切下該差異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析,將獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Mascot軟件中的串級質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能(MS/MS Ions Search)進(jìn)行搜索鑒定,初步篩選獲得6個可能與Cyp B相互作用的病毒相關(guān)蛋白。上述研究結(jié)果將不僅為從病毒與宿主互作角度闡明ORFV的致病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為利用Cyp B途徑阻斷ORFV的感染提供有價值的資料。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

第二篇 研究內(nèi)容 第 1 章 CypB 在 ORFV 早期感染宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位1.3 結(jié)果1.3.1 免疫熒光標(biāo)記觀察結(jié)果正常 MDBK 細(xì)胞接種 ORFV 4h 后制成細(xì)胞爬片，同時制作未接毒的正常MDBK 細(xì)胞爬片作為對照。應(yīng)用間接免疫熒光染色法，利用激光共聚焦顯微鏡初步觀察 CypB 蛋白在 ORFV 早期感染 MDBK 細(xì)胞前后的定位分布情況。結(jié)果顯示無論病毒感染前（圖 1.1）后（圖 1.2）在 MDBK 細(xì)胞的胞漿中均可見較亮的綠色熒光，部分細(xì)胞核位置出現(xiàn)較暗綠色熒光。

MDBK 細(xì)胞爬片作為對照。應(yīng)用間接免疫熒光染色法，利用激光共聚焦顯微鏡初步觀察 CypB 蛋白在 ORFV 早期感染 MDBK 細(xì)胞前后的定位分布情況。結(jié)果顯示無論病毒感染前（圖 1.1）后（圖 1.2）在 MDBK 細(xì)胞的胞漿中均可見較亮的綠色熒光，部分細(xì)胞核位置出現(xiàn)較暗綠色熒光。圖 1.1 正常 MDBK 細(xì)胞內(nèi) CypB 的分布定位（標(biāo)尺: 10μm）A: 細(xì)胞核熒光顯色 B: CypB 蛋白熒光顯色 C: 合并顯色Fig.1.1 Fluorescent photos of normal MDBK cells (Scale bar = 10μm)A, Fluorescent photos of cellular nucleus; B, Fluorescent photos of CypB; C, Merge

第二篇 研究內(nèi)容 第 1 章 CypB 在 ORFV 早期感染宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位早期感染 MDBK 細(xì)胞前后的定位分布情況。結(jié)果顯示病毒感染前（圖 1.3 箭頭所示）或病毒感染后（圖 1.4 箭頭所示）在 MDBK 細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上均可見較多膠體金顆粒。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2767710