【摘要】：目的對豬圓環(huán)病毒3型遼寧分離株(LN-PCV3)的分子特征進行分析,并依據(jù)廣泛流行的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)給養(yǎng)豬業(yè)帶來的重大經(jīng)濟損失,特別是二者混合感染,帶來更大經(jīng)濟損失的現(xiàn)狀,本研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)分別構建了表達PCV3 Cap基因的單聯(lián)疫苗和融合表達PCV2和PCV3 Cap蛋白基因的二聯(lián)疫苗,并對其免疫原性進行評估,為PCV2和PCV3的綜合防治儲備了物質基礎。方法參照湖北分離株HB-PCV3-2016(GenBank登錄號:KY954038.1)設計特異性引物,以PCR檢測PCV3陽性的樣品為模板,對全基因進行PCR擴增,將PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后,與pMD-18-T載體進行連接,轉化到DH5a感受態(tài)細胞中,篩選得到的陽性克隆菌落進行質粒提取,進行酶切鑒定,酶切鑒定正確的質粒送生工生物公司進行測序。將測序得到的基因序列用Mega7.0和DNAStar軟件進行分析,與GenBank公布的PCV3其他分離株基因序列進行比對和分子特性分析。在此基礎上,分別選取PCV2疫苗株PCV2-SH(登陸號:HM038027.1)的Cap蛋白基因和LN-PCV3的Cap蛋白基因,用剛性連接肽Linker將PCV2 Cap蛋白基因與PCV3 Cap蛋白基因進行連接融合,作為免疫原基因。根據(jù)昆蟲細胞密碼子偏愛性、對免疫原基因進行人工修飾、優(yōu)化和合成,獲得免疫原基因PCV2-3-Cap,并克隆至pMD-18-T載體,構建重組質粒T-PCV2-3-Cap。分別以優(yōu)化后的PCV3-Cap蛋白基因和PCV2-3-Cap融合蛋白基因為靶基因,設計特異性引物,以T-PCV2-3-Cap為模板,擴增PCV3-Cap和PCV2-3-Cap蛋白基因,轉化到DH5a感受態(tài)細胞中,篩選得到的陽性克隆菌落進行質粒提取,進行酶切鑒定。將鑒定正確的PCV3-Cap基因和PCV2-3-Cap融合基因克隆至pFastBac 1載體上,分別構建桿狀病毒轉移載體pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap。將pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap分別轉化到DH10Bac感受態(tài)細胞中進行轉座,經(jīng)過藍白斑篩選后,提取重組桿粒,并轉染SF9昆蟲細胞,通過篩選獲得表達PCV3 Cap基因與共表達PCV2和PCV3 Cap融合基因的重組桿狀病毒,經(jīng)PCR,SDS-PAGE,Western blot,免疫熒光,電鏡等實驗方法鑒定正確后,用蔗糖密度離心法對病毒進行純化。所得的純化病毒作為免疫原,以1x10~8pfu的重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap免疫BALB/c小鼠,并設免疫對照組,每隔2周進行一次免疫,連續(xù)免疫三次,分別在首免后0d,14d,28d,42d對小鼠尾部進行采血并分離血清。用ELISA方法檢測PCV2和PCV3的抗體水平。首免后42d,處死小鼠摘取脾臟,通過CCK-8法計算各免疫組之間小鼠的淋巴細胞增值指數(shù)SI。按照細胞因子檢測試劑盒的使用方法,對免疫小鼠的IL-2,IL-4,IFN-γ等細胞因子進行檢測,從而驗證PCV3-Cap蛋白基因、PCV2-3-Cap融合蛋白基因在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達效果及其免疫原性。結果通過PCR方法從PCV3陽性樣品中,克隆到PCV3全基因序列,長度為2000bp,命名為LN-PCV3(GenBank登錄號:MH177453.1)。遺傳進化樹分析顯示,我國目前流行的PCV3分離株可形成3個分支(3a簇、3b簇與3c簇),LN-PCV3株處于3a簇分支中,與湖北株HB-PCV3-2016(GenBank登錄號:KY354039.1)同源性最高,達到99.7%。在此基礎上,將構建的重組桿狀病毒轉移載體pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap,分別轉化到DH10Bac感受態(tài)細胞中進行轉座后,PCR交叉檢驗證明獲得重組桿粒rAcBacmid-PCV3-Cap和rAcBacmid-PCV2-3-Cap。然后將重組桿粒轉染SF9昆蟲細胞,制備重組桿狀病毒,重組桿狀病毒連續(xù)傳代3次,傳代3次(P3代)重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap經(jīng)透射電鏡觀察,可見假病毒粒子和桿狀病毒粒子。用M13通用引物、PCV3-Cap基因特異引物、PCV2-3-Cap基因特異性引物分別進行PCR擴增,可見674bp與2974bp,1514bp與3814bp處出現(xiàn)目的片段,大小均與理論值一致。分別通過SDS-PAGE和Western blot檢測,在30kD與55kD處出現(xiàn)目的條帶。通過免疫熒光實驗,兩組重組蛋白在熒光顯微鏡下均出現(xiàn)綠色熒光,正常細胞未出現(xiàn)熒光效果,證明PCV3-Cap基因、PCV2-3-Cap融合基因在SF9細胞中獲得表達,并且成功篩選到重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap�？贵w水平檢測結果表明,rvAc-PCV3-Cap和rvAc-PCV2-3-Cap免疫組PCV3抗體水平均明顯高于PBS陰性對照組與PCV2滅活苗陽性對照組,差異顯著(P0.05),但rvAc-PCV3-CAP和rvAc-PCV2-3-Cap免疫組間PCV3抗體水平差異不顯著(P0.05)。rvAc-PCV2-3-Cap免疫組PCV2抗體水平均明顯高于PBS陰性對照組和rvAc-PCV3-Cap組,差異顯著(P0.05),但與PCV2滅活苗陽性對照組相比,抗體水平差異不顯著(P0.05)。CCK-8法檢測小鼠脾淋巴細胞增值指數(shù)(SI)的結果顯示,rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap免疫組、PCV2滅活苗陽性對照組均與PBS組相比,SI值差異顯著(P0.05),但其他三個免疫組間相比,差異并不顯著(P0.05)。細胞因子水平檢測表明,證明注射重組桿狀病毒組能夠刺激機體提高IL-2,IL-4,IFN-γ的分泌水平,與PCV2滅活苗組差異不顯著(P0.05),但明顯高于PBS陰性對照組(P0.05)。結論1.成功對LN-PCV3進行了全基因克隆,并對其分子生物學特性進行了分析。2.利用桿狀病毒表達系統(tǒng)實現(xiàn)了PCV3 Cap蛋白基因和PCV2、PCV3 Cap蛋白融合基因的表達,并成功篩選到了重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap。3.小鼠免疫實驗表明重組桿狀病毒rvAc-PCV3-Cap與rvAc-PCV2-3-Cap能夠刺激機體產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫應答,為豬圓環(huán)病毒新型疫苗研制提供了技術支持和物質儲備。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：

L/well 加入 TMB，37℃避光孵育 30min。100μL/well 加入迅速加入 Stop solution 終止長 450nm 讀值。定制標準曲線，計算 IL-4 的濃度。結 果毒 3 型全基因克隆及分子特性研究N 株全基因克隆結果V3 的陽性病料用已經(jīng)設計好的全基因引物進與理論值相符。(圖 1) 。

圖 2 T-PCV3 陽性質粒酶切鑒定結果A Marker DL5000；1.PCV3 基因酶切 2.陰性對 的分子特性研究源性分析結果顯示 PCV3 可分為 3 大分支 LN-PCV3 與 USMO-PC-PCV3-2017,SH-PCV3-2016 同屬與 3a 簇性最高，達到 99.7%，與其他 3a 簇同源性在 株基因的同源性在 98.4%～99.7%之間同源性為 98.3%（如圖 3，圖 4 所示）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 劉長明,陸月華,張超范,危艷武,劉煥章,童光志;豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白在昆蟲桿狀病毒中的表達[J];中國預防獸醫(yī)學報;2005年06期

相關碩士學位論文 前1條

1 張家明;豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達及亞單位疫苗的初步研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2010年

本文編號：2742941