發(fā)布時間：2020-06-30 00:23

【摘要】：山羊痘病毒(Goat pox virus, GTPV)、綿羊痘病毒(Sheep pox virus, SPPV)、牛疙瘩皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)、傳染性膿皰病毒(Contagious ecthyma virus, CPDV)、藍舌病病毒(bluetongue virus, BTV)、小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)能引起反芻動物急性、熱性傳染病,發(fā)病率高,危害嚴重。6種病毒中除傳染性膿皰病毒外,其余五種病毒均為OIE通報疫病病毒；我國農(nóng)業(yè)部將山羊痘、綿羊痘、牛疙瘩皮膚病、藍舌病、小反芻獸疫列為一類疫病,羊傳染性膿皰為三類疫病。此外,山羊痘、綿羊痘、傳染性膿皰亦是人畜共患傳染病,在危害畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失的同時,對人類健康也構成嚴重危害。目前,國內(nèi)未見牛疙瘩皮膚病流行的報道。由于這6種疫病均以皮膚、黏膜產(chǎn)生皰疹、潰瘍?yōu)橄嗨婆R床癥狀,常呈混合感染,僅從臨床癥狀上難以診斷與區(qū)分。傳統(tǒng)的診斷方法如病毒分離鑒定、血清學方法有操作繁瑣、耗時費力、靈敏度低、假陽性率高等不足,難以同時對多種病原進行檢測。因此,應臨床和口岸快速通關檢測需要,急需建立一種快速、準確、靈敏、穩(wěn)定性好,且能同時鑒別診斷上述6種疫病病原的檢測方法。GeXP-PCR (Gene eXpress Profiler-polymerase chain reaction)是將通用引物與特異性嵌合引物按比例混合進行PCR擴增,由GeXP系統(tǒng)對經(jīng)染色標記處理的擴增產(chǎn)物進行片段長度的測定的一種新技術,具有特異性強、靈敏度高、高通量等優(yōu)點。近年來GeXP系統(tǒng)常用于基因表達分析、病毒檢測等領域的研究與運用。本研究以山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病毒、傳染性膿皰病毒、藍舌病病毒、小反芻獸疫病毒為對象,優(yōu)化建立GeXP多重PCR檢測方法。該方法能同時對上述6種牛羊病毒性病原進行鑒別檢測,為山羊痘等6種疫病的鑒別診斷、疫情監(jiān)控、流行病學調查、出入境動物檢疫等提供技術保障,對保障我國的畜牧業(yè)生產(chǎn)安全、人類健康具有十分重要的意義。主要研究內(nèi)容與結果如下：(1)根據(jù)山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病毒、傳染性膿皰病毒、藍舌病病毒和小反芻獸疫病毒的保守序列設計了6對特異性引物,經(jīng)PCR擴增、目的片段的克隆及測序,結果發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物與GenBank中各毒株的同源性都在97%以上,表明設計的6對特異性引物均能擴增出目標序列。(2)通過對特異性嵌合引物的引物濃度及退火溫度進行優(yōu)化,分別建立6種牛羊病毒性病原的GeXP單重PCR體系,進行單重GeXP-PCR的靈敏度試驗,并與OIE推薦方法進行比較。結果表明,牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒的靈敏度為103copies/μL;山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍舌病病毒的靈敏度可達到102 copies/μL。可見,GeXP單重PCR檢測方法具有較高的靈敏度,比OIE推薦方法的靈敏度(106～107copies/μL)高10000～100000倍。(3)建立并優(yōu)化6種牛羊病毒性病原GeXP多重PCR檢測體系,并進行特異性、靈敏度試驗。特異性試驗結果顯示,牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒、山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍舌病病毒均產(chǎn)生了清晰且與預期目標片段大小相符的特異性擴增峰,呈陽性；其余的毒株均無非特異性擴增,呈陰性,說明本研究所建立的方法特異性良好。靈敏度檢測結果顯示,發(fā)現(xiàn)6種病原單管擴增均能同時檢測到的靈敏度達104copies/μL。(4)用本研究建立的GeXP多重PCR檢測方法和OIE推薦的方法對模擬臨床樣本進行檢測。在制備的54份模擬樣品中,GeXP多重PCR檢測方法的陽性率為94.87%,假陽性率為6.67%,假陰性率為5.13%。在35份單獨感染的模擬樣本(除CPDV)及陰性樣本中,GeXP多重PCR檢測方法的陽性率為95%,假陽性率為6.67%%,假陰性率為5%；OIE推薦方法檢測的陽性率為70%,假陽性率為O%,假陰性為30%。結果表明,GeXP多重PCR檢測方法較大程度地提高了陽性率并減小了假陰性率,可采用本研究建立的方法對臨床樣本進行檢測�？傊�,本研究建立的GeXP多重PCR,能同時檢測牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒、山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍舌病病毒,且特異性好、靈敏度高,為預防和監(jiān)控上述6種牛羊病毒性病原提供了一種快速、準確、靈敏的診斷方法。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2734575