【摘要】：哺乳動物乳腺組織在哺育下一代時分泌乳汁為其成長提供營養(yǎng)以及免疫保護,乳汁中的主要成分包括乳蛋白、乳脂肪、乳糖等,牛乳也是人類生活中必不可少的優(yōu)質食品。乳合成相關的信號轉導通路、調控乳合成的關鍵信號分子及其作用機制是畜牧學亦是生命科學研究的重要內容。PURB是Pur蛋白家族中成員,Pur家族蛋白可以形成同型和異型復合物,并且特異性地以高親和力結合富含嘌呤的ssDNA(有義或反義)或RNA。它們優(yōu)先結合含有GGN(N不是G)重復序列。本研究前期發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍彼?Met)刺激時牛乳腺上皮細胞(BMECs)PURB表達量顯著增加,提示PURB作為轉錄因子可能對BMECs的乳的合成起調控作用。目前,國際上有關PURB的功能和作用機制的研究較少,尚無研究揭示PURB對BMEC乳合成是否發(fā)揮作用。本實驗擬揭示PURB在氨基酸促進BMECs乳蛋白和乳脂肪合成中的作用及其分子機理。本研究通過組織塊法培養(yǎng)和純化BMECs,得到的原代BMECs進行傳代培養(yǎng),-80℃凍存?zhèn)溆�。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長速度,免疫熒光(IF)法鑒定細胞的純度:檢測細胞中β-酪蛋白(β-casein)和角蛋白18(Cytokeratin 18)的表達。在培養(yǎng)液中添加0.6 mmol/L Met或0.6 mmol/L Leu,qRT-PCR和western blotting實驗結果表明α-casein和β-casein表達量顯著提高。脂滴實驗結果與甘油三酯(TG)檢測實驗表明,Met和Leu能夠顯著促進BMECs乳脂肪的合成。通過以上實驗成功地建立了氨基酸調節(jié)乳合成的體外細胞培養(yǎng)模型。qRT-PCR和western blotting結果表明PURB蛋白和mRNA的表達量在Met和Leu作用時顯著上升。IF檢測PURB的亞細胞定位,顯示PURB定位在胞核中,Met、Leu處理增強PURB在胞核中的定位。這些結果表明,Met和Leu能夠顯著促進BMECs中PURB的表達和核定位,提示在Met和Leu上調乳蛋白和乳脂肪合成的過程中,PURB可能是一個重要的調節(jié)因子。利用重組質粒和siRNA對PURB基因進行過表達和干擾。PURB基因過表達時,PURB、α-casein和β-casein表達量顯著提高,TG分泌和脂滴的合成顯著提高,mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平也顯著提高;PURB基因干擾時,PURB、α-casein及β-casein表達量顯著降低,TG分泌和脂滴的合成顯著降低,mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平也顯著降低。以上研究結果表明,PURB具有正向調節(jié)mTOR和SREBP-1c信號分子從而促進乳蛋白和乳脂肪合成的作用。為了探究PURB接受Met和Leu刺激從而調節(jié)乳合成的分子機制,應用PI3K抑制劑沃曼青(wortmannin)抑制PI3K信號通路。Western blotting分析表明PI3K抑制完全阻斷了2種氨基酸對PURB表達的促進作用。結果表明Met和Leu通過PI3K途徑促進PURB蛋白表達。為進一步探究PURB是否介導Met和Leu調節(jié)mTOR和SREBP-1c信號分子,細胞添加Met或Leu時同時轉染PURB siRNA。Western blotting分析表明PI3K抑制完全阻斷了兩種氨基酸對mTOR磷酸化和SREBP-1c蛋白水平的促進作用。結果表明PURB介導Met和Leu調節(jié)mTOR和SREBP-1c信號途徑。采用染色質免疫共沉淀(ChIP)-PCR和ChIP-qPCR鑒定PURB與mTOR、SREBP-1c基因的啟動子(-1~-2 000bp)可能發(fā)生結合的位點。結果發(fā)現(xiàn)PURB與mTOR、SREBP-1c基因的啟動子各存在一個結合位點。ChIP-qPCR結果顯示,Met和Leu刺激促進PURB與靶基因啟動子的結合。PURB基因過表達和干擾發(fā)現(xiàn)PURB正向調節(jié)mTOR和SREBP-1c的mRNA水平。這些實驗結果表明Met和Leu刺激PURB表達并促進與PURB與mTOR、SREBP-1c的基因啟動子結合,啟動基因轉錄。已有研究提示PURB在基因轉錄中起著關鍵作用,但與許多其他轉錄因子相比,國際上發(fā)表的結果較少。本研究發(fā)現(xiàn)在BMECs中,PURB是牛乳腺細胞中乳蛋白和乳脂肪合成的正向調控因子。PURB位于細胞核,氨基酸(Met和Leu)通過PI3K信號途徑促進PURB表達。PURB可以與mTOR和SREBP-1c基因啟動子結合促進其轉錄,Met和Leu刺激這種結合。PURB介導Met和Leu對mTOR和SREBP-1c表達的刺激,導致乳蛋白和乳脂肪合成增加。綜上,在BMECs中PURB介導Met和Leu信號促進mTOR和SREBP-1c基因轉錄從而促進乳蛋白和乳脂肪合成。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.2
【圖文】：

前 言合成途徑及調控機制成分組成的場所腺組織在哺育下一代時分泌乳汁為其成長提供營養(yǎng)以及免疫蛋白、乳脂肪、乳糖等，牛乳也是人類生活中必不可少的種間差異，這些差異可能反映了哺乳期奶牛的生物化學代謝差異[2]。，乳突中乳腺上皮組織包含許多由腺泡（alveolus）組成的將乳汁排到乳頭[3]。每個小葉（如圖 1-1）包含由多個腺泡單位[4]。

含量和組成存在種間差異，這些差異可能反映了哺乳期奶牛的生物化學代謝過程和哺乳幼仔的營養(yǎng)需求存在差異[2]。在哺乳期間，乳突中乳腺上皮組織包含許多由腺泡（alveolus）組成的小葉（lobule）并連接到輸乳管，將乳汁排到乳頭[3]。每個小葉（如圖 1-1）包含由多個腺泡（alveolus），這些小葉是乳汁分泌單位[4]。圖 1-1 乳汁分泌單位[4]Fig.1-1Milk secreting units腺泡由單層極化的腺泡乳腺上皮細胞（mammary epithelial cell, MEC）組成（如圖 1-2）排列在管腔周圍，分泌乳汁。腺泡連接到由雙層乳腺上皮細胞形成的輸乳管[5]。腺泡 MEC 接觸基膜（basic membrane，BM），一種專門的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）并被收縮的肌上皮細胞（myoepithelial cell）包圍。乳腺小泡嵌入含有膠原、內皮細胞（endothelicell）、脂肪細胞和成纖維細胞（fibroblast）的基質中。

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

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本文編號：2727301