【摘要】：肉雞在集約化養(yǎng)殖模式下存在一系列免疫和應(yīng)激問題,尤其在肉雞養(yǎng)殖前期,各種疫病的發(fā)生率高且危害大,這與肉雞年齡階段性的免疫功能特性有關(guān)。基于此,我們針對性的選取黃芪多糖(Astragalus Polysacchirides,APS)作為免疫營養(yǎng)調(diào)控因子,結(jié)合營養(yǎng)表觀遺傳調(diào)控策略,利用APS改變父母代種公雞腸道中的免疫微環(huán)境,經(jīng)長期刺激后研究其免疫相關(guān)傳代性調(diào)控效應(yīng)及其營養(yǎng)表觀遺傳調(diào)控機制,并分析APS在體外試驗中的免疫調(diào)節(jié)作用及相關(guān)信號通路因子,探討采用APS誘導(dǎo)的父系傳代免疫調(diào)控效應(yīng)應(yīng)對肉雞前期免疫性能低下問題的可行性。試驗一、種公雞胸腺免疫的年齡階段差異性本試驗采用單因素試驗設(shè)計,120只1日齡科寶500種公雞,分為15籠飼喂,每籠8只雞,用以分析種公雞胸腺免疫性能的年齡階段差異性。在2周齡(雛雞)和40周齡(成年雞),每籠選取一只接近平均體重的種公雞進行屠宰試驗,采集胸腺樣品進行表型分析和轉(zhuǎn)錄組測序分析,并對核心調(diào)控因子的啟動子甲基化修飾進行檢驗,以解釋胸腺免疫功能的年齡階段差異性及其維持機制。試驗結(jié)果顯示:成年雞的胸腺質(zhì)量和形態(tài)與雛雞存在顯著差異(P≤0.05);鑒于這種表型差異性,本試驗采用RNA-seq方法分析了胸腺中基因在轉(zhuǎn)錄水平的基因表達狀況,用以確定年齡相關(guān)免疫功能差異的分子調(diào)控機理,Pearson相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果均顯示成年雞和雛雞胸腺中基因在轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達模式存在顯著差異,雛雞和成年雞間有1949個差異表達基因(Differentially Expressed Genes,DEGs,其中成年雞胸腺中有1822個高表達基因,127個低表達基因)。基于DEGs的GO和KEGG功能富集性分析結(jié)果篩選獲得4個免疫相關(guān)顯著富集性KEGG信號通路,分別為細胞因子-細胞因子受體互作通路、腸道Ig A合成免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、Toll樣受體信號通路和糖尿病并發(fā)癥相關(guān)通路,這就說明肉雞胸腺免疫功能,包括抗原識別、炎癥反應(yīng)及腸道黏膜免疫等均具有發(fā)育階段差異性。與這4條免疫相關(guān)信號通路相關(guān)的差異表達基因在雛雞組均顯示低表達(P≤0.05)特性,說明2-W雛雞胸腺中4條免疫相關(guān)信號通路均呈現(xiàn)低活性狀態(tài)。肉雞胸腺免疫的年齡階段性差異可維持較長時間,DNA甲基化修飾可滿足這一基因表達調(diào)控特性,所以我們檢驗了CD40啟動子甲基化修飾狀況,CD40與4條免疫信號通路的3條具有高相關(guān)性,且與胸腺免疫功能調(diào)控緊密相關(guān),且雛雞胸腺中的CD40啟動子甲基化修飾水平極顯著(P≤0.01)高于成年雞,這與基因的表達差異性一致,維持基因在雛雞階段的低表達特性和相關(guān)通路的低活性。本試驗說明肉雞胸腺免疫功能具有年齡階段差異性,相比于成年雞,雛雞的胸腺免疫處于一種低活性狀態(tài),此調(diào)控效應(yīng)與雛雞胸腺中CD40啟動子高甲基化相關(guān)的基因表達抑制存在一定相關(guān)性。試驗二、飼糧添加黃芪多糖對種公雞免疫性能的影響肉雞發(fā)育前期胸腺TLR信號通路保持低活性狀態(tài),影響其免疫功能狀態(tài),而APS可適度激活TLR4信號通路,優(yōu)化機體免疫活性狀態(tài),本試驗擬探索種公雞長期攝入APS對其免疫和生產(chǎn)性能的影響。我們檢測了飼糧長期(40周)添加APS對種公雞體重、腸道黏膜組織形態(tài)、血清細胞因子、腸道黏膜及脾臟免疫的影響。本試驗采用單因素試驗設(shè)計,160只科寶500種公雞隨機分為5組,在其玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中分別飼喂0、0.01、0.10、1.00和10.00 g/kg APS,每個處理4重復(fù),每個重復(fù)8只雞,將種公雞飼喂至44周齡,稱量種公雞體重并采集血清樣品,左側(cè)頸靜脈放血屠宰后采集各小腸腸段、小腸黏膜和脾臟樣品進行試驗分析。我們之前的試驗發(fā)現(xiàn)由于種公雞飼養(yǎng)過程中需要嚴格限飼,飼糧中添加APS對種公雞體重并無顯著影響,但飼糧添加10.00 g/kg APS可顯著改善種公雞腸道黏膜組織形態(tài)(后續(xù)分子指標分析選取10.00g/kg APS處理組),腸道黏膜更新需依賴于APS的免疫刺激作用。所以,本試驗首先采用抑菌環(huán)和梯度稀釋法試檢驗了APS的直接抑菌效應(yīng),試驗結(jié)果顯示APS并無直接抑菌效應(yīng),APS免疫調(diào)節(jié)作用更多源自于其對免疫系統(tǒng)的直接影響,進而我們分析了APS對腸道黏膜和脾臟免疫的影響。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)種公雞飼糧添加10.00 g/kg APS對空腸黏膜中TLR4信號通路、細胞因子、內(nèi)毒素耐受及腸道組織形態(tài)相關(guān)基因的表達均無顯著影響;血清中細胞因子IFN-α、IFN-β和IL-4濃度亦無顯著差異性;種公雞脾臟中,飼糧添加APS對TLR4相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄亦無系統(tǒng)性影響。總之,種公雞飼糧中添加10.00 g/kg APS可顯著改善其腸道黏膜組織形態(tài),但源于種公雞免疫系統(tǒng)對飼糧中長期(44周)添加APS的適應(yīng)性,APS對種公雞空腸黏膜及脾臟免疫功能均無顯著影響。試驗三、種公雞飼糧添加黃芪多糖對商品代肉雞免疫的影響由于種公雞免疫系統(tǒng)對APS長期刺激的適應(yīng)性,種公雞日糧添加APS對其本身腸道黏膜和脾臟免疫并無顯著影響,本試驗旨在探討種公雞飼糧添加APS對商品代肉雞生長狀況和免疫性能的傳代調(diào)控作用。本研究采用單因素試驗設(shè)計,在基礎(chǔ)日糧中分別添加0、0.01、0.10、1.00和10.00 g/kg APS,每個處理4重復(fù),每個重復(fù)8只雞,將種公雞飼喂至40周齡后每個重復(fù)選取一只高繁種公雞采集精液,并分別為每個重復(fù)對應(yīng)的12只種母雞輸精,在5天里連續(xù)3次輸精后采集種蛋,每個重復(fù)選取重量在65到70 g之間的受精蛋20枚用于孵化試驗以獲得商品代肉仔雞,每個重復(fù)獲得16只商品代肉雞,商品代肉雞根據(jù)種公雞處理進行分組,商品代肉雞飼喂商品顆粒料,不額外添加APS,自由飲水,飼喂于環(huán)控倉中且不進行疫苗免疫,商品代肉雞飼喂至2周齡(采集每天體重數(shù)據(jù))時左側(cè)頸靜脈放血屠宰后采集血清、小腸腸段、小腸黏膜和脾臟樣品。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),種公雞飼糧添加10.00 g/kg APS可傳代性的改善商品代肉雞養(yǎng)殖前期的體重和空腸黏膜組織形態(tài),基于此表型差異性,選取10.00 g/kg APS處理組進行進一步的分子檢驗;種公雞飼糧APS可誘導(dǎo)商品代肉雞空腸黏膜免疫系統(tǒng)TLR4信號通路產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受樣反應(yīng)狀態(tài),APS對TLR4表達無影響,TLR4信號通路下游TRIF通路激活而My D88信號通路保持相對靜息狀態(tài),NF-κB表達顯著(P≤0.05)提高,種公雞飼糧添加APS顯著(P≤0.05)提高了IFN-α和IFN-β的表達,趨勢性(0.05≤P≤0.1)提高了IL-4和IL-6的表達,并顯著(P≤0.05)提高了IL-4上游調(diào)控因子GATA3的表達,內(nèi)毒素耐受調(diào)控因子SOCS1的表達極顯著(P≤0.01)升高,IFN-α下游的STAT1表達顯著(P≤0.05)升高,總之,種公雞飼糧添加10.00g/kg APS可通過活化TLR4下游的TRIF通過,并活化IFN-α/β及其下游的內(nèi)毒素耐受因子SOCS1,誘導(dǎo)商品代肉雞空腸黏膜免疫系統(tǒng)TLR4信號通路的內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng);腸道黏膜免疫活性可通過血液循環(huán)系統(tǒng)影響系統(tǒng)免疫活性,種公雞飼糧添加10.00 g/kg APS可顯著(P≤0.05)提高商品代肉雞血清I類干擾素(IFN-α和IFN-β)水平;進一步分析APS對脾臟免疫的父系傳代調(diào)控作用,與腸道黏膜免疫系統(tǒng)類型,種公雞飼糧APS可影響商品代肉雞脾臟中的TLR4信號通路活性,誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng),其下游通路My D88通路抑制,而TRIF通路被激活,種公雞飼糧中添加APS對商品代肉雞脾臟中細胞因子的表達亦有顯著影響,可顯著(P≤0.05)提高TNF-α和IL-6的表達,并可顯著(P≤0.05)提高IL-4及其上游調(diào)控因子GATA3的表達,但促炎細胞因子和內(nèi)毒素耐受調(diào)控因子的表達均無顯著變化�？傊�,本試驗說明種公雞飼糧中長期添加高劑量APS可誘導(dǎo)商品代肉雞空腸黏膜和脾臟免疫的TLR4信號通路內(nèi)毒素耐受免疫反應(yīng),并可通過其免疫調(diào)控效應(yīng)改善商品代肉雞的腸道黏膜組織形態(tài)和生長狀況。試驗四、黃芪多糖對腸上皮細胞TLR4信號通路活性的影響TLR信號通路是最重要的免疫識別信號通路,基于試驗一,我們發(fā)現(xiàn)雛雞胸腺TLR4信號通路處于抑制狀態(tài),所以本論文擬采用APS針對性的適度激活TLR4通路,來改善肉雞免疫性能。試驗二、三結(jié)果發(fā)現(xiàn)APS可通過父系傳代調(diào)控作用改善商品代肉雞的腸道黏膜免疫性能,進而通過血液循環(huán)系統(tǒng)影響脾臟免疫功能。本試驗選用Caco2細胞作為腸道上皮細胞模型,并構(gòu)建LPS內(nèi)毒素耐受免疫模型,結(jié)合LPS炎癥反應(yīng)模型,探討APS對腸道上皮細胞免疫狀態(tài)的影響,并通過RNA干擾在轉(zhuǎn)錄水平抑制TRIF通路活性,分析APS免疫反應(yīng)類型及其相關(guān)信號通路調(diào)控因子。試驗第一部分采用單因素隨機試驗設(shè)計,分為5組,對照組(C),APS處理組(APS,1mg/m L),LPS處理組(LPS,1 ug/m L),APS+LPS組(AL)及LPS內(nèi)毒素耐受組(ET),每個處理3個重復(fù)。采用q RT-PCR和流式細胞分析方法分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢驗TLR4信號通路、細胞因子及內(nèi)毒素耐受調(diào)控因子相關(guān)基因的表達狀況,并采用ELISA試劑盒檢驗Caco2細胞IL-1、IL-8及TNF-α的合成和分泌活性。試驗結(jié)果顯示LPS刺激可誘導(dǎo)TLR4-My D88相關(guān)炎性細胞毒性反應(yīng),活化TLR4信號通路,并顯著(P≤0.05)提高促炎細胞因子的表達,促進(P≤0.05)IL-8的合成和分泌活性,而APS可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),顯著(P≤0.05)降低IL-8的合成和分泌,產(chǎn)生類似于內(nèi)毒素耐受反應(yīng)的基因表達特性。第二部分試驗采用2×3拉丁方試驗設(shè)計,兩個處理因素分別為TRIF干擾和APS及LPS處理,分別為(對照組、TRIF干擾組)×(對照組、LPS處理組、APS+LPS處理組),分別為對照組(Control)、LPS處理組(LPS)、APS+LPS處理組(AL)以及TRIF干擾組對應(yīng)的對照組(s-Control)、LPS處理組(s-LPS)和APS+LPS處理組(s-AL),每個處理設(shè)置3個重復(fù)。分析TRIF抑制狀況下APS和LPS刺激對Caco2細胞的調(diào)控效應(yīng),試驗結(jié)果顯示TRIF敲除后,APS不能有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),TLR信號通路活性及促炎細胞因子的表達均表現(xiàn)出與LPS處理組高度的一致性,促炎細胞因子IL-8仍保持較高的合成和分泌活性。綜上,在Caco2細胞模型中,APS可TRIF依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細胞毒性反應(yīng),并顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細胞因子高表達,進一步可確定APS可影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)的活性狀態(tài),從側(cè)面驗證說明APS的父系傳代調(diào)控效應(yīng)是源于其對腸道黏膜免疫的影響。試驗五、黃芪多糖父系傳代性調(diào)控效應(yīng)中的表觀遺傳修飾作用本試驗采集APS父系傳代試驗中對照組和10.00 g/kg APS處理組種公雞空腸黏膜、脾臟及精液樣品,和商品代肉雞空腸黏膜和脾臟樣品,并檢驗其關(guān)鍵調(diào)控因子My D88、TRIF和SOCS1的啟動子甲基化和組蛋白修飾狀況,用以探討APS以精子為媒介的營養(yǎng)表觀遺傳修飾作用。試驗結(jié)果顯示就DNA甲基化修飾而言,種公雞飼糧APS可顯著(P≤0.05)降低種公雞空腸黏膜和精子中的的SOCS1啟動子甲基化修飾水平,商品代肉雞空腸黏膜中的SOCS1啟動子甲基化也有一定程度的降低,且SOCS1啟動子Cp G富集區(qū)段為轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合區(qū),APS誘導(dǎo)的低甲基化有利于促進SOCS1的表達,且精子中SOCS1啟動子的低甲基化可作為傳代調(diào)控因子參與APS的父系傳代調(diào)控效應(yīng);APS對My D88、TRIF及脾臟中SOCS1的啟動子甲基化修飾并無顯著影響,只有組織特異性的低甲基化修飾;種公雞飼糧中的APS可顯著(P≤0.05)影響空腸黏膜和脾臟中My D88和TRIF基因啟動子區(qū)段的組蛋白修飾(脾臟SOCS1啟動子Dimethyl-H3K9修飾亦有顯著提高),誘導(dǎo)符合基因表達特性的組蛋白修飾類型。另外,種公雞飼糧添加APS可顯著提高(P≤0.05)精子中My D88的Dimethyl-H3K9修飾水平,并可顯著(P≤0.05)降低精子中TRIF的Dimethyl-H3K9修飾水平�？傊�,在APS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受樣父系傳代調(diào)控過程中,DNA甲基化(空腸黏膜SOCS1)和組蛋白修飾(My D88和TRIF)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。試驗結(jié)論:肉雞雛雞階段的系統(tǒng)免疫活性處于相對抑制狀態(tài),而APS可誘導(dǎo)TLR4-TRIF通路相關(guān)內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng),可針對性改善肉雛雞免疫性能,通過種公雞飼糧添加APS可通過父系營養(yǎng)表觀遺傳機制傳代誘導(dǎo)商品代肉雞腸道黏膜免疫系統(tǒng)TLR4信號通路的內(nèi)毒素耐受免疫反應(yīng),并影響外周免疫器官脾臟的免疫狀態(tài),進而可優(yōu)化肉仔雞前期的腸道形態(tài)和生長狀況,在肉仔雞獲得期望性狀�？傊�,APS通過父系營養(yǎng)表觀遺傳機制改善商品代肉雞免疫和體增重是一種應(yīng)對肉雞雛雞階段免疫抑制問題的可行性策略。
【圖文】：

本研究的技術(shù)路線

40 周齡成年雞的胸腺質(zhì)量極顯著高于（P ≤ 0.01）2 周齡雛雞（圖2-1A，但成年雞的胸腺指數(shù)極顯著（P ≤ 0.01）低于雛雞（圖 2-1C）。另外，成年雞與雛雞胸腺外觀形態(tài)有顯著差異，雛雞胸腺更加圓潤，，相比于雛雞，成年雞的胸腺更加細長平�。▓D 2-1B）。種公雞胸腺質(zhì)量和形態(tài)在雛雞和成年雞間存在顯著差異性。圖 2-1 種公雞胸腺質(zhì)量和表型Figure 2-1 Weight and morphology of thymus in breeder cocks
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S831.5


本文編號：2693208