【摘要】：禽呼腸孤病毒(AvianReovirus,ARV)是一種重要的禽類病原,在臨床上引起多種病型,譬如病毒性關節(jié)炎、慢性呼吸道疾病、生長遲緩和吸收不良綜合征,而且ARV感染會造成家禽的免疫抑制,加劇其它病原感染的風險,給家禽養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟損失。p10是由ARVS1基因編碼的非結構蛋白,屬于I型跨膜蛋白,是ARV重要的毒力因子。其主要作用是在細胞膜上穿孔,破壞宿主細胞的細胞膜,促使細胞融合進而有利于病毒擴散,是引起合胞體形成的主要因素。然而,該蛋白在宿主細胞內會被迅速降解。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),ARVp10在細胞內與溶酶體膜相關蛋白-1(Lysosome Associated Membrane Protein-1,LAMP-1)發(fā)生相互作用,并通過蛋白酶體途徑降解,而且LAMP-1在p10降解中發(fā)揮重要作用,然而LAMP-1如何在p10降解中發(fā)揮作用以及p10降解的分子機制尚不十分清楚。本研究利用免疫共沉淀和激光共聚焦顯微鏡檢測技術,證實ARV p10和E3泛素連接酶Siah-1發(fā)生相互作用,進一步通過分子生物學以及免疫沉淀檢測技術,確定p10的N端胞外區(qū)(1aa～43aa)和Siah-1的C端底物結合區(qū)(141aa～282aa)相結合。在DF-1細胞中,過表達Siah-1可以促進p10的降解,并且這種降解作用能被蛋白酶體抑制劑MG132抑制,說明p10降解依賴于泛素化蛋白酶體途徑。利用RNAi技術沉默內源Siah-1表達,使p10的表達量明顯提高。過表達Siah-1則促進p10的泛素化水平,相反RNAi干擾Siah-1表達明顯抑制p10的泛素化,該結果證明Siah-1促使p10泛素化。同時通過體外泛素化實驗也證明Siah-1促使p10泛素化。此外,在DF-1細胞中過表達Siah-1或以RNAi沉默Siah-1表達后感染ARV,檢測病毒復制情況,結果發(fā)現(xiàn)過表達Siah-1明顯抑制病毒增殖,相反干擾Siah-1的表達會使病毒增殖顯著增強,并且細胞形成合胞體的數(shù)量也顯著提高,說明Siah-1在ARV增殖中發(fā)揮重要作用。在ARV感染的情況下,以p10單抗與細胞裂解物作免疫沉淀,結果表明p10單抗可以將p10蛋白、Siah-1以及LAMP-1同時沉淀下來,說明p10同時與Siah-1和LAMP-1相互作用,三者形成復合物。如果以RNAi干擾細胞內源性LAMP-1表達,p10與Siah-1的免疫共沉淀的量明顯減少,而且p10與Siah-1共定位的量也隨之減少,同時Siah-I促進p1 0降解的能力也下降。該結果表明在ARV感染情況下,Siah-1通過與LAMP-1以及p10形成復合物引起p10泛素化,從而使p10通過蛋白酶體途徑降解。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)宿主細胞感染ARV后,E3泛素連接酶Siah-1通過泛素化ARV p10蛋白使其降解,抑制病毒增殖。在此過程中,LAMP-1招募Siah-1以及p10形成復合物,促進Siah-1與p10結合,起到橋梁的作用,進而使p10泛素化并通過蛋白酶體途徑降解,抑制ARV增殖。該研究結果揭示了 Siah-1在LAMP-1促進p10降解中起關鍵作用,為進一步研究ARV感染的致病機理提供重要參考。
【圖文】：

圖２－１邋ＰＣＲ擴增}0／？－／基因逡逑Ｍ：分子量標準，？邋１：邋Ｓ／Ｍ－／ＰＣＲ產(chǎn)物．？邋２：陰性對照逡逑

圖２－２邋ＤＦ－１細胞中轉染表達的Ｓｉａｈ－１融合蛋白的表達檢測逡逑Ａ：邋ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ或ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ－Ｓｉａｈ－１邋轉染ＤＦ－丨細胞３６邋ｈ后，，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測蛋白表達：逡逑
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2655710