【摘要】：豬瘟和口蹄疫分別感染豬和偶蹄動物,傳播范圍廣,危害大,造成了嚴重的經(jīng)濟損失。當前主要采用病毒弱毒苗和滅活苗防控,但是兩者都有一定的缺陷,所以研發(fā)一種抗豬瘟和口蹄疫病毒的基因工程亞單位疫苗十分必要。研究發(fā)現(xiàn),豬瘟病毒結構蛋白E0、E2和口蹄疫病毒結構蛋白中的VP1蛋白能夠誘導動物體內(nèi)產(chǎn)生針對病毒的中和抗體。因此,本實驗利用慢病毒轉基因技術,制備豬瘟和口蹄疫病毒重要結構蛋白奶山羊乳腺生物反應器。構建了豬瘟病毒結構蛋白E0、E2和口蹄疫病毒結構蛋白(VP1蛋白)外源基因的慢病毒表達載體,包裝病毒顆粒,轉染山羊乳腺上皮細胞驗證豬瘟病毒結構蛋白E0、E2和口蹄疫病毒結構蛋白(VP1蛋白)在宿主細胞內(nèi)的表達;用慢病毒感染胚胎,制備轉基因羊,獲得如下結果:1.利用PCR技術克隆了CSFV-E0、CSFV-E2、AFMDV-VP1、OFMDV-VP1目的基因,并在5’端加His-Flag標簽;克隆兩個乳腺特異性的BLG啟動子,分別為BLG5和BLG11;利用上述元件構建出乳腺特異性的慢病毒載體PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1雙酶切鑒定驗證了載體構建成功。2.將慢病毒包裝質粒PMD2G、PSPAX和慢病毒載體質粒PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1共轉293T細胞,得到了帶有目的基因的慢病毒,感染乳腺上皮細胞,RT-PCR和Western blotting檢測到乳腺上皮細胞上清中有CSFV-E2、CSFV-E0、AFMDV-VP1和OFMDV-VP1的表達。3.利用超數(shù)排卵技術,獲得山羊受精卵180枚,將病毒液注射到受精卵透明帶間隙,選擇存活的胚胎149枚,移植受體50只,獲得后代35只,經(jīng)PCR鑒定,獲得PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1轉基因羊4只,PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1轉基因羊6只,PCDH-BP5/11-CSFV-E0轉基因羊3只,PCDH-BP5/11-CSFV-E2轉基因羊3只。
【圖文】：

恒溫搖床 上海�，攲嶒炇以O備有限公司 China2.1.3 載體和菌株如圖2-1所示慢病毒骨架載體PCDH-CMV-EF1-copGFP，質粒PMD-18T構自TaKaRa公司，E.coli Trans5α 感受態(tài)細菌，慢病毒包裝質粒 PMD2G、PSPAX 本實驗室保存有，293T 細胞本實驗室保存。9

用Cla I和Sal I酶切PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測到基因條帶（圖2-5），載體酶切結果與預期一致。切膠回收，送測序，比對測序結果，序列一致表明重組慢病毒穿梭載體構建成功。19
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2643274