【摘要】：為了解廣西地區(qū)禽白血病(avian leukosis,AL)的流行情況和及時掌握毒株的變異趨勢,本研究對2014-2018過去5年廣西地區(qū)不同養(yǎng)殖場送檢至本實驗的臨床發(fā)病剖檢疑似有典型AL癥狀的雞只進行禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)的分離與鑒定。通過將其血漿或病變組織樣品的濾過液接種至DF-1進行細胞培養(yǎng)病毒分離,將收集的細胞培養(yǎng)物上清液進行ALV-p27檢測,檢測結(jié)果為陽性的樣品進一步進行其它病原的PCR鑒定以及ALV亞群的PCR擴增,并用單克隆抗體進行IFA確定ALV的亞群,從中挑選確定為ALV-J單一感染的10株病毒分離株進行全基因序列測定與分析。結(jié)果顯示,10株分離毒的基因組全長在7583～7648 bp之間,其核苷酸、氨基酸之間的相似性都較高分別為96.0%～98.8%、96.8%～98.9%,分離株與ALV-J參考株的相似性在91%以上,而與ALV-A、B、C、D、E、K亞群的相似均較低至63.1%～86.3%。遺傳進化樹分析的結(jié)果顯示,分離株與ALV-J參考株的親緣關(guān)系近同屬于一個大分支,而與ALV-A、B、C、D、E、K亞群的參考株親緣關(guān)系較遠且處于不同的分支,確定10株分離毒均屬ALV-J;對分離株與ALV-J參考株的3個主要基因gag、pol、env進行比對的結(jié)果顯示,其gag和pol基因均比較保守,與參考株之間的相似性均在94%以上,而其囊膜蛋白env所表現(xiàn)的差異性則相對較大,相似性在90%～95%之間,進一步對env基因編碼的兩個結(jié)構(gòu)蛋白gp85和gp37進行分析發(fā)現(xiàn),gp37基因比較保守,分離株與ALV-J參考株之間的相似性較高(92.7%～99.0%),而分離株與參考株gp85之間的相似性差異較大(85.9%～96.0%)。由于gp85的序列決定著ALV亞群的分型,因此10株分離毒與ALV-J參考株gp85的相似性均比較高,而與其他亞群之間的相似性則低至38.1%～59.7%;對gp85的熵值分析顯示,ALV-Jgp85的主要變異區(qū)域集中在hr1和hr2;對其LTR的分析顯示,分離株與ALV-J參考株的LTR差異性也較大,相似性為87.0%～97.8%;進一步對LTR的U3區(qū)序列的分析顯示,分離株與ALV-J參考株的相似性在86.3%～98.1%,且分離株GX17YL05、GX17NN06與ALV-J參考株GX14ZS04、GX14HG01及NHH在U3區(qū)均出現(xiàn)了 11個堿基的連續(xù)缺失,而另外8株分離毒均無11 bp的缺失。本研究對所得分離毒與ALV-J參考株序列比較發(fā)現(xiàn),10株廣西ALV-J毒株的基因序列整體變化不大。2014年本課題組從某育種公司使用的商品雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)(新-支二聯(lián))商品活疫苗和雞傳染性喉氣管炎(傳喉)商品活疫苗分別分離鑒定到ALV-J毒株GX14YYA1和GX14YYD2。為探究免疫有外源性ALV污染的活疫苗對雞群的致病性,本研究模擬疫苗在生產(chǎn)上的常規(guī)接種程序,分別進行了滴鼻和點眼1 d齡首免及7 d齡二免有ALV-J污染的新-支二聯(lián)疫苗,1 d腹腔注射從傳喉疫苗中分離純化出來的ALV-J毒株GX14YYD2以及35 d齡點眼免疫污染有ALV-J的傳喉疫苗,同時分別設置了無ALV-J污染的新-支二聯(lián)疫苗和傳喉疫苗的免疫對照組及空白對照組,所有雞只在7 d齡進行ND、AIV-H5和AIV-H9油乳劑商品疫苗的免疫,分別在1d、1W、3W、4W、5W、8W、11W、15W、21W以及25W進行體重、病毒血癥、病毒載量、抗體效價、體外排毒等相關(guān)指標的檢測。結(jié)果顯示,1d齡首免、7 d齡二免有ALV-J污染的新-支二聯(lián)疫苗組和1 d腹腔注射從傳喉疫苗中分離純化出來的GX14YYD2組與兩個對照組相比,雞只受到了ALV的感染,表現(xiàn)體重顯著降低(p≤0.05);免疫器官的正常發(fā)育和功能也受到顯著影響,脾臟與對照組相比腫大(p≤0.05)、胸腺和法氏囊則都是萎縮的(p≤0.05),對常規(guī)油乳劑疫苗的免疫應答效果也顯著降低(p≤0.05);雞只的心臟出現(xiàn)了肉眼可見的ALV-J型血管瘤特征的血皰;而35 d齡免疫污染有ALV-J的傳喉疫苗組和兩個對照組在整個實驗期內(nèi)均沒有臨床發(fā)病,也沒有檢測到ALV病毒血癥的存在。研究的結(jié)果證明,1 d齡首免、7 d齡二免有外源性ALV-J污染的新-支二聯(lián)禽活疫苗,可以引起三黃雞的感染并導致臨床發(fā)病。本課題研究的結(jié)果說明,過去5年臨床獲得的10株ALV-J病毒的全基因序列整體變化不大,同時證明了免疫有外源性ALV-J污染的疫苗是其在商業(yè)雞群中的傳播途徑之一。
【圖文】：

子特異性的核酸酶Ｈ的活性，同時ｂ亞單位還有一個ＩＮ結(jié)構(gòu)域即整合酶ｐ３２，病毒ＤＮＡ整合進宿主細胞染色體基因中具有重要的作用。逡逑襄膜蛋白基因ｍｖ與病毒的抗原性、組織親嗜性以及毒力有關(guān)，對致腫起關(guān)鍵作用，同時也跟ＡＬＶ毒株的變異、感染宿主的范圍［３８］以及致瘤的類型有編碼ＳＵ表面蛋白和ＴＭ跨膜蛋白，這２種蛋白中較大的ＳＵ蛋白位于病纖突表面，呈球形，由ｇｐ８５基因編碼，較小的ＴＭ蛋白將纖突與囊膜連接ｇｐ３７基因編碼，這兩種囊膜蛋白連在一起形成一個二聚體稱為病毒糖蛋白。ｇｐ８５是ＡＬＶ亞群分類的主要依據(jù)也是病毒抗原的主要成分，當病毒欲侵入時ｇｐ８５則與靶細胞膜上的特異性受體識別后結(jié)合，而ｇｐ３７則主要負責將病靶細胞［４°］。對于ＡＬＶ－Ｊ來說，ｅｎｖ的變異將決定了不同ＡＬＶ－Ｊ毒株之間的毒力而不同ＡＬＶ－Ｊ邋ｅｎｖ基因之間的同源性也存在著很大的差異［４ｎ。ＡＬＶ病毒粒子圖邋２－１。逡逑ＴＭ邐ＳＵ逡逑

然后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物繼續(xù)被加工后轉(zhuǎn)運至細胞團，以ｍＲＮＡ的形式翻譯產(chǎn)生ｅ？ｖ、／？0／、講＾逡逑蛋白等，最后完成組裝后從宿主細胞中釋放出去，進一步加工成為具有感染性的病逡逑毒粒子［４２１，如圖１－３。逡逑ｃ＃逡逑—ｚ－邋ａ逡逑ｌ邋Ｃｃｒ＾ｒ＜－：夕、＃逡逑一，邐ｒ，＊＂＂ｃ逡逑圖１－３邋ＡＬＶ病毒增殖模式圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＬＶ邋ｖｉｒｕｓ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑１．１．７外源性與內(nèi)源性ＡＬＶ逡逑作為具有感染性病毒粒子進行傳播的ＡＬＶ叫做外源性ＡＬＶ，邋ＡＬＶ－Ａ？Ｄ、Ｆ？Ｋ逡逑共１０個亞群均為外源性ＡＬＶ。外源性ＡＬＶ既可以水平傳播也可以通過雞胚將ＡＬＶ逡逑從父母代垂直傳染給子代，，還可以以病毒粒子的形式進行傳播％４３１。而內(nèi)源性ＡＬＶ逡逑與外源性是相對的，內(nèi)源性ＡＬＶ不以病毒粒子的形式進行傳播，其本身就在雞的體逡逑內(nèi)存在并且可以整合到宿主細胞染色體中，通過孟德爾遺傳定律進行垂直傳播，內(nèi)逡逑源性病毒粒子可能只是病毒基因組的完全或不完全片段［４４］。雖然內(nèi)源性ＡＬＶ的致病逡逑性通常很弱或不具有致病性［４５］，不會引起雞群腫瘤，但它們同樣會表達ＡＬＶ的Ｐ２７逡逑蛋白基因
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：2639513