【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一種由鐮刀菌屬菌株產生的非甾體伴雌激素樣作用的霉菌毒素,其污染遍布世界各地。ZEA的毒性作用見于生殖系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等,但相關機制尤其是分子機制還沒有完全探明。目前,關于ZEA暴露對動物免疫細胞中T淋巴細胞活化功能的研究報道較少,為探究ZEA免疫毒性的機理,本實驗以分離的小鼠原代T淋巴細胞為材料,研究了 ZEA對T細胞體外活化的信號轉導通路以及活化過程中相關免疫功能的影響。1.ZEA對小鼠T淋巴細胞活性及活化標志信號的影響采用免疫磁珠負性分選等技術從6-8周齡Balb/c小鼠脾臟中分離獲得原代T淋巴細胞,以0(空白對照),2.5,5,10,20,40,80μM的ZEA同時處理未添加/添加活化劑ConA(5μg/mL)的淋巴細胞48h、72h、96h,CCK-8法檢測ZEA對T細胞活力的影響;96孔U型底培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞觀察細胞聚團現(xiàn)象;流式細胞術檢測ZEA對T細胞各期活化分子的表達。結果顯示,未添加ConA的各染毒組T細胞的活性與對照組相比均無明顯變化(p0.05);Con A對照組與空白對照組相比細胞活性均明顯上升(pp0.01);48h時20μM ZEA及以上濃度處理組細胞活性均明顯低于Con A組(p0.05或p0.01),72h及96h時1 0μM ZEA及以上濃度處理組細胞活性均較ConA組極顯著下降(p0.01),并呈劑量-效應關系。96孔U型培養(yǎng)板培養(yǎng)72h后,空白對照組細胞幾乎看不到克隆團,ConA組出現(xiàn)了大量的克隆團;10μMZEA處理組細胞聚團現(xiàn)象受到抑制,20μM及40μMZEA處理組細胞聚集團開始產生皺縮。雙熒光染色流式檢測顯示,與空白對照組比較,ConA組T細胞早、中、晚期活化標志蛋白CD69、CD25、CD71均有大量表達(p0.01);與ConA對照組相比,10μM ZEA及以上濃度處理組T細胞CD69、CD25、CD71陽性表達率均有下降(p0.05或p0.01),并呈劑量-效應關系。2.ZEA對TCR信號通路的影響以小鼠原代T淋巴細胞為材料,設立空白對照組(不含ConA)、ConA(5μμg/mL)對照組、ZEA(20 及 40μM)+ConA(5μg/mL)處理組,共同處理 24h 后,利用 westernblot方法檢測TCR信號通路中接頭蛋白LAT的表達水平,活化起始調控蛋白Lck、Zap-70的表達和磷酸化水平,T淋巴細胞活化核因子NF-AT通路和NF-κB通路關鍵蛋白的表達水平,以及核因子NF-AT和NF-κB入核表達的情況;利用流式細胞術分析了不同濃度ZEA(10、20及40μM)對ConA刺激下的T淋巴細胞TCR通路中共刺激分子CD28、CD152的影響。westemblot檢測不同濃度ZEA(20μM及40μM)對ConA刺激下的T淋巴細胞活化共刺激分子CD28介導的下游PI3K-Akt-mTOR信號通路的影響。結果顯示,Con A組細胞LAT表達量較空白對照組明顯上升(p0.01),不同濃度ZEA處理組LAT的表達量均較Con A組顯著下降(p0.01),不同濃度ZEA處理組Lck、Zap-70的表達水平及其磷酸化水平均較Con A組下降(p0.01)并呈現(xiàn)劑量-效應關系,不同濃度ZEA處理組活化核因子NF-AT、NF-κB通路中關鍵蛋白的表達量及它們入核表達水平均較ConA組下降(p0.05)。隨ZEA染毒濃度的升高,細胞CD28的表達水平呈下降趨勢,40μM ZEA處理組較Con A組差異顯著(p0.05);10、20μM ZEA處理組細胞CD152分子的表達水平均較Con A組顯著下降(p0.05),40μM ZEA處理組細胞CD152表達水平較Con A組卻差異不顯著(p0.05)。不同濃度ZEA處理組細胞CD28介導的下游PI3K-Akt-mTOR信號通路中關鍵蛋白的表達量均較Con A組顯著下降(p0.05或p0.01)。3.ZEA對活化T細胞細胞因子、趨化因子分泌及趨化因子受體表達的影響以小鼠原代T淋巴細胞為材料,設立空白對照組(不含ConA)、ConA(5μng/mL)對照組、ZEA(10、20及40μM)+Con A(5μg/mL)處理組,共同處理培養(yǎng)48h、72h后,利用流式液相多重蛋白定量技術檢測細胞因子IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、GM-CSF及趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平;染毒培養(yǎng)24h后,利用流式細胞術檢測T淋巴細胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達。結果顯示,ConA組細胞因子IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF及趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平均較空白對照組極顯著升高(p0.01),各濃度ZEA處理組IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF等五種細胞因子的分泌均較ConA組極顯著下降(p0.01)且呈劑量-效應關系;隨ZEA染毒濃度的升高,細胞趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平呈下降趨勢,20μM ZEA及以上濃度處理組MIP-1α分泌量較Con A組顯著降低(p0.05),40μM ZEA處理組RANTES分泌量較Con A顯著降低(pp0.05);流式雙染結果顯示,Con A組T細胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達量均較空白組極顯著升高(p0.01),隨ZEA染毒濃度的升高,T細胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達量均呈下降趨勢,20μM ZEA及以上濃度處理組CCR2表達量較Con A組顯著降低(p0.05),40[μMZEA處理組CCR7表達量較ConA組顯著降低(pp0.05)結論,ZEA可通過干擾TCR及共刺激信號通路抑制經Con A刺激的T淋巴細胞活化過程,同時可以抑制活化T淋巴細胞分泌細胞因子及趨化因子的功能,并在一定程度上抑制T細胞參與的趨化效應,從而導致動物機體發(fā)生免疫抑制。
【圖文】：

：玉米赤霉烯酮對小鼠Ｔ淋巴細胞活化的影響及機制章細胞免疫應答與Ｔ淋巴細胞活主要指由免疫細胞介導的各種免疫效應作用，，其的識別是Ｔ細胞對抗原進行免疫應答的起始階段，面抗原受體，與抗原遞呈細胞（ＡＰＣ）表面的－ＭＨＣ異性結合，此時，抗原識別過程開始。當信號傳應受體ＴＣＲ發(fā)生特異性結合而啟動時，轉錄因子表達。這一過程的信號轉導導致Ｔ細胞活化，發(fā)生胞因子［４５］。逡逑Ｌｙｍｐｈ邋ｎｏｄ？邐，邐Ｔｕｍｏｒ邋ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ逡逑

ＰＤ．Ｌ１邋０逡逑！邋Ｘ逡逑ＣＣＲ４逡逑圖２－１細胞免疫發(fā)生過程逡逑１Ｔ細胞介導的免疫效應逡逑抗體與循環(huán)或組織液中的外源入侵微生物結合，之后將其破壞消滅，然而并非所有的逡逑入侵微生物都生活在細胞外，病毒和某些細菌寄生在細胞內抗體達不到的部位，因此抗體逡逑在保護機體抵抗這些入侵者方面的作用有限，病毒和其他細胞內感染的微生物，必須通過逡逑其他機制進行消滅［４６，４７］。對此，機體采用兩種不同的方法：要么使感染細胞被快速殺死，逡逑使得入侵的微生物沒有生長的時間，要么使感染細胞產生消滅胞內微生物的能力。在這之逡逑中，Ｔ細胞介導的各種免疫效應發(fā)揮了重要的作用。逡逑１．１細胞毒性Ｔ細胞介導的凋亡途徑逡逑細胞能殺死自己，機體在需要時誘導其衰老、過剩、損傷或異常的細胞死亡，否則它逡逑們會干擾正常組織功能
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S859.8

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