【摘要】：寄生線蟲不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,而且還可以感染人,嚴重影響人類的健康。WHO組織評估全球有超過10億人口感染寄生線蟲,在傷殘調(diào)整生命年中,寄生線蟲的影響超過了糖尿病和肺癌患者。大規(guī)模和長期抗寄生蟲藥物的使用已經(jīng)誘導(dǎo)出寄生蟲抗藥性的產(chǎn)生,因此新藥的開發(fā)迫在眉睫,而新型抗寄生線蟲藥物以及疫苗的研發(fā)需要對寄生線蟲發(fā)育過程中關(guān)鍵基因的功能進行深入研究。蛋白激酶在寄生線蟲發(fā)育生物學(xué)和生殖發(fā)育學(xué)等過程中發(fā)揮著重要作用,以蛋白激酶作為藥物靶標治療疾病的研究已有報道,但在寄生線蟲中的研究還寥寥無幾。RIOK-2蛋白激酶是一種新發(fā)現(xiàn)的非典型蛋白激酶,在酵母和人細胞核糖體生物合成、細胞周期調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用。盡管如此,該分子在線蟲中的功能還所知甚少。本項目選取人獸共患寄生線蟲糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)作為研究對象,從結(jié)構(gòu)和功能兩方面對糞類圓線蟲RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ss-riok-2進行了研究;同時利用模式生物自由生活的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的轉(zhuǎn)基因和RNAi技術(shù)研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ce-riok-2的功能。(一)糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的結(jié)構(gòu)分析本研究通過RACE-PCR獲得了Ss-riok-2基因的c DNA序列,其中編碼區(qū)為1572bp,共編碼523個氨基酸。通過氨基酸比對發(fā)現(xiàn)編碼的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能結(jié)構(gòu)域。利用生物信息學(xué)軟件對Ss-RIOK-2蛋白三級結(jié)構(gòu)進行同源建模,預(yù)測了Ss-RIOK-2蛋白與ATP、金屬離子結(jié)合的關(guān)鍵活性位點,為開發(fā)以RIOK-2蛋白作為潛在的抗寄生蟲藥物靶標奠定理論基礎(chǔ)。通過Genomewalker PCR獲得Ss-riok-2基因的g DNA,其長度為1620bp,包含一個48bp的內(nèi)含子。預(yù)測的Ss-riok-2基因啟動子序列全長1308bp,含有真核生物保守的調(diào)控元件。(二)糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的表達、轉(zhuǎn)錄水平及定位分析體外原核表達和純化了Ss-RIOK-2融合蛋白,進一步的激酶活性實驗驗證了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通過轉(zhuǎn)錄組分析,Ss-riok-2基因在蟲體各個階段都有轉(zhuǎn)錄且在寄生雌蟲中最高。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻鱏s-riok-2基因啟動子可以驅(qū)動gfp基因表達在F1代幼蟲的腸道組織。(三)秀麗隱桿線蟲Ce-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的功能分析預(yù)測的Ce-riok-2基因啟動子序列全長1269bp,轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻鰿e-riok-2基因啟動子也可以驅(qū)動gfp基因表達在F1代幼蟲的腸道組織。當幼蟲進入deaur時期時表達減弱。反轉(zhuǎn)錄PCR檢測到Ce-riok-2基因在性腺組織中也有轉(zhuǎn)錄。通過ds RNA飼喂法干擾Ce-riok-2基因在秀麗隱桿線蟲中的表達,結(jié)果導(dǎo)致Ce-riok-2基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),同時引起Ce-vit-2基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)且導(dǎo)致蟲體發(fā)生以下表型變化:1.蟲體的發(fā)育減慢;2.蟲體不育;3.蟲體的陰門突出;4.成蟲的性腺細胞減少和細胞大小紊亂。本研究首次研究了寄生線蟲糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ss-riok-2基因的結(jié)構(gòu)和功能,并驗證了自由生活線蟲秀麗隱桿線蟲Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上結(jié)果為進一步闡明RIOK蛋白激酶在秀麗隱桿線蟲、糞類圓線蟲及相關(guān)寄生線蟲生長發(fā)育過程中的分子生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

是 1876 年 Normand 從一名患有腹瀉疾病的996)。糞類圓線蟲屬于桿形目(Rhabditata)、類圓ides) 線蟲(林海和楊光友 2016)。糞類圓線蟲的，自由生活雌蟲的體長約 900-1700 μm，寄生rove 1996, 牟海燕等 2001)。糞類圓線蟲可以寄的小腸粘膜內(nèi)引起糞類圓線蟲病，嚴重者會導(dǎo)為“被忽視的熱帶病”(Olsen et al 2009)，尤其染，導(dǎo)致糞類圓線蟲大量繁殖，嚴重危害人類蟲的生活史trongyloides stercoralis)的生活史較其他寄生線蟲生活史，包括宿主體內(nèi)的寄生循環(huán)(the Parasitthe Free-living cycle)。寄生生活中只有雌蟲，自

圖 1-3 我國糞類圓線蟲的感染病例分布(Wang et al 2013Fig. 1-3 Cumulative cases and distribution of strongyloidiasis in(Wang et al 2013)圓線蟲的發(fā)病機理及臨床表現(xiàn)線蟲感染是我國常見的蠕蟲類寄生蟲病之一，主要發(fā)病機理向小腸移行引起疾病。糞類圓線蟲病可引起胃腸道癥狀,包括，皮膚問題包括瘙癢、皮炎和呼吸道癥狀,如咳嗽、呼吸 al 2002, Keiser and Nutman 2004, 李松林 2001)。當患者的如患有 T 細胞淋巴型病毒病、腎臟移植病、艾滋病等惡性類圓線蟲病，往往會影響多個宿主器官，嚴重時可導(dǎo)致死亡ing and Weiss 2006, Sarangarajan et al 1997)。慢性無癥狀類圓感染(Grove 1996)，當同時應(yīng)用免疫抑制治療時，它又極有重度感染(Keiser et al 2004)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.731

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