【摘要】：硒是發(fā)揮著重要生物學功能的一種關鍵的微量元素。日糧中缺乏硒可造成雞多種器官中發(fā)生一系列的臨床和病理改變。與其它組織相比較,腎臟的硒含量較高,腎臟也是硒缺乏的靶器官之一,硒缺乏能夠引起雞腎功能衰退、氧化應激和腎纖維化,此外還影響細胞周期進程以及引起細胞凋亡,而硒補充則會緩解這些癥狀。有研究表明miRNAs也參與腎臟的許多疾病的發(fā)生,miR-33是高度保守的miRNA家族,它在許多疾病方面發(fā)揮著重要作用,其中也包括細胞周期及細胞凋亡,然而目前關于miR-33在缺硒肉雞腎臟細胞凋亡中的作用還不清楚。為探討miR-33-3p及其相應的靶基因在缺硒腎臟細胞周期及凋亡中的作用,本研究通過復制缺硒雞模型,應用超微結構觀察、實時熒光定量PCR技術、雙熒光素酶報告基因、AO-EB等技術,檢測了缺硒腎臟中β-catenin通路的一些相關基因(E-cadherin、β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)及凋亡相關基因(Bcl-2、Bax、Bak、Caspase3)和去整合素域和金屬蛋白酶域蛋白10(ADAM10)mRNA和蛋白的表達水平以及miR-33-3p的表達水平。在建立體外miR-33-3p過表達和敲低的雞胚原代腎細胞模型基礎上,預測并驗證了miR-33-3p的靶基因是ADAM10,通過敲低和過表達體外培養(yǎng)的雞胚原代腎細胞中的miR-33-3p,檢測腎臟β-catenin通路相關基因及凋亡相關基因的表達。試驗結果如下:(1)在建立體外培養(yǎng)雞胚原代腎細胞細胞模型的基礎上,成功構建了miR-33-3p過表達和敲低模型,過表達效率為46倍,敲低效率是0.45倍。利用生物信息學預測軟件TargetScan和miRDB預測了miR-33-3p可以與ADAM10基因的3’UTR片段結合,表明ADAM10可能是miR-33-3p的一個靶基因。另外,通過構建雙熒光素酶報告基因、RT-PCR和western blot的方法確認了ADAM10是miR-33-3p的靶基因之一。(2)低硒飼料能夠引起雞腎臟組織中miR-33-3p表達上調(diào)和ADAM10表達下調(diào),miR-33-3p上調(diào)9倍,ADAM10表達下調(diào)46%,并且引起E-cadherin表達上調(diào),而β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin表達下調(diào),促凋亡基因Bak、Bax和Caspase3表達上調(diào),相反的,抑凋亡基因Bcl-2表達下調(diào),同時超微組織結構觀察的結果發(fā)現(xiàn)缺硒中腎臟細胞凋亡率顯著增多。上述結果表明,miR-33-3p及其靶基因ADAM10與低硒引起腎臟細胞凋亡相關。(3)為了確認miR-33-3p對雞胚原代腎細胞的細胞周期及凋亡的影響,我們建立了雞原代體外培養(yǎng)腎臟細胞miR-33-3p過表達和敲低模型,結果表明雞胚原代腎細胞過表達miR-33-3p時,細胞周期相關基因(β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)表達下調(diào),細胞凋亡相關基因Bak、Bax和Caspase3表達水平上調(diào),而Bcl-2則下調(diào),同時通過流式細胞術檢測轉染miR-33-3p mimic之后細胞周期及細胞凋亡情況,結果表明轉染miR-33-3p mimic后細胞周期阻滯,在G0/G1期細胞數(shù)量明顯增加,細胞凋亡率也明顯增加,而在雞胚原代腎細胞中敲低miR-33-3p后,細胞中細胞周期及細胞凋亡相關基因的表達水平發(fā)生變化,細胞周期相關基因(β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)表達上調(diào),細胞凋亡相關基因Bak、Bax和Caspase3表達水平下調(diào),而Bcl-2則上調(diào),并且轉染miR-33-3p inhibitor后則流式細胞術檢測結果也表明細胞周期進程順利進行且細胞凋亡率明顯下降。最后我們通過AO-EB方法也證明在雞胚原代腎細胞中過表達miR-33-3p會增加細胞凋亡率,而抑制細胞中的miR-33-3p水平則會降低細胞凋亡率。這些結果表明miR-33-3p能夠通過抑制ADAM10表達引起雞胚原代腎細胞發(fā)生細胞周期阻滯及細胞凋亡。綜上所述,低硒日糧能夠引起miR-33-3p表達上調(diào),并通過負調(diào)控靶基因ADAM10,進一步促進了細胞周期阻滯及細胞凋亡。本試驗為探索miRNA與硒缺乏之間的相互作用機制奠定了基礎,并為防治缺硒性腎臟損傷機制提供理論依據(jù)。
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實驗路線圖

ADAM10 3’UTR 單鏈寡核苷酸進行退火，由此 μL（100 μM），加入 48 μL 無菌水于 EP 管中用。膠電泳及膠回收純化進行電泳及膠回收純化。將退火后的產(chǎn)物進行核酸按照膠回收試劑盒說明書進行相應條帶的回收與純的構建體進行酶切、純化，，表達載體名稱為 pMIR-REP
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 盛鵬飛;硒蛋白W與低硒致雞腦損傷的相關性研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2014年

相關碩士學位論文 前2條

1 姚海東;硒蛋白W抗氧化功能及其在雞缺硒性骨骼肌細胞凋亡作用中的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2013年

2 蔣志惠;硒蛋白W對雞肝臟細胞凋亡影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2013年

本文編號：2620212