【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種急性、高度的腸道傳染性疾病,其特征為哺乳仔豬嚴(yán)重水樣腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率。本研究測定PEDV-HN13株S基因全序列,并對S1基因中具有多個抗原表位的區(qū)域進(jìn)行串聯(lián),分別進(jìn)行原核表達(dá)和真核表達(dá),最后對兩種蛋白作體液免疫效果的評價。具體研究內(nèi)容如下:1.PEDV-HN13株S基因全序列分析根據(jù)PEDVCV777 S基因設(shè)計了 3對相互重疊的引物,以擴(kuò)增PEDV-HN13株S基因全序列。利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù),獲得目的基因,然后將其連接到pGEM-TEasy載體中;轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。對陽性克隆進(jìn)行測序,確定各片段的序列后拼接出S基因全序列。將PEDV-HN13株S基因全序列與其他國內(nèi)外的24株P(guān)EDVS基因序列進(jìn)行比較,并使用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明,25株P(guān)EDV可分為兩個基因群即G I群和GⅡ群:GⅠ群主要由經(jīng)典毒株組成,GⅡ群主要是由近年來的變異毒株組成,而PEDV-HN13 屬于 G Ⅰ 群。2.PEDV部分S1抗原位點基因串聯(lián)的原核表達(dá)通過生物信息學(xué)分析PEDV-HN13株S1蛋白,選取抗原性較強(qiáng)表位集中的兩個區(qū)域,針對這兩個區(qū)域設(shè)計2對引物,利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增出串聯(lián)基因,命名為PEDV-S1-F;將F基因克隆進(jìn)pGEM-TEasy載體,通過測序分析顯示與原始序列相一致。將酶切后的目的片段克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1上,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGST-PEDV-S1-F,并在BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)1PTG誘導(dǎo)后,成功表達(dá)重組蛋白,蛋白的大小為36KD。經(jīng)過SDS-PAGE和Western-blot鑒定后,目的蛋白存在于上清中。使用GST純化試劑盒進(jìn)行純化獲得條帶單一、純度高的重組蛋白。3.PEDV部分S1抗原位點基因串聯(lián)的真核表達(dá)含有正確串聯(lián)基因序列的陽性質(zhì)粒與真核表達(dá)載體pFast-Bac-HTA分別進(jìn)行雙酶切,經(jīng)膠回收后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組質(zhì)粒pFast-PEDV-S1-F;并將其在DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)座,經(jīng)藍(lán)白斑篩選和純化,獲得重組穿梭載體質(zhì)粒Bacmid-PEDV-S1-F。將PCR鑒定正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中,27℃培養(yǎng)7天左右收獲病毒,經(jīng)過三次的病毒增殖,獲得高滴度的重組桿狀病毒。經(jīng)過IFA、SDS-PAGE和Western-blot分析重組rBac-PEDV-S1-F桿狀病毒,結(jié)果證明,重組rBac-PEDV-S1-F桿狀病毒在Sf9昆蟲細(xì)胞中得到了表達(dá)。4.兩種不同系統(tǒng)表達(dá)的蛋白的免疫效果評價制備S1-F重組蛋白免疫原及表面展示S1-F重組桿狀病毒的細(xì)胞性免疫原免疫Balb/c小鼠,首免后間隔14d免疫小鼠,共免疫三次。分別在首免后14、28和42d采集小鼠血清。通過間接免疫熒光、微量細(xì)胞培養(yǎng)中和實驗對免疫原刺激小鼠產(chǎn)生的體液免疫進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,pGST-PEDV-S1-F蛋白免疫血清中存在特異性抗體,抗體效價達(dá)到1:200,并具有一定的中和能力,中和效價達(dá)到1:8。而rBac-PEDV-S1-F重組桿狀病毒,抗體效價達(dá)到1:800,并具有一定的中和能力,中和效價也達(dá)到1:8。本研究將PEV-HN13 S1蛋白的抗原位點串聯(lián)表達(dá)于原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中,以用于PEDV疫苗的研發(fā),并取得了一定初步成果,為PEDV基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

１－４所知，ＰＥＤＶ－ＨＮ１３株與ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ－ＣＶ７７７處于同一分支，都屬于Ｇ邋Ｉ進(jìn)化群。逡逑ＰＥＤＶ－ＨＮ１３株屬于Ｇ邋Ｉ群，與經(jīng)疫苗毒株ＣＶ７７７、致弱毒株ＤＲ１３和經(jīng)典毒株ＣＶ７７７、逡逑ＤＲ１３親緣關(guān)系較近，在遺傳進(jìn)化上存在的距離比較近（圖１－４）。逡逑

３．２邐ＰＥＤＶ邋ＳＩ蛋白串聯(lián)基因片段的ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑按照上述ＰＣＲ程序，用ＰＣＲ方法擴(kuò)增了邋ＰＫ）Ｖ－ＨＮ１３毒株的Ｆ１和Ｆ２基因片段。ＰＣＲ逡逑產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳分析后，圖２－２可見大小約為１２３ｂｐ和１３８ｂｐ左右的條帶，用逡逑Ｆ１和Ｆ２膠回收產(chǎn)物作模板，ＰＥＤＶ－Ｓ１－Ｆ１和ＰＥＤＶ－Ｓ１－Ｒ２作引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小約逡逑為２６１ｂｐ左右的拼接后的條帶，與預(yù)計大小相符合。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651

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本文編號：2620073