【摘要】：奶牛乳腺發(fā)育和泌乳受到多種信號通路的嚴格調(diào)控,揭示和闡明泌乳相關(guān)的信號通路以及乳腺代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是泌乳生物學領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容,為提高奶品質(zhì)和奶產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。Folliculin(FLCN)基因作為抑癌基因,廣泛參與多種代謝途徑和細胞過程,在細胞粘附、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)合成和線粒體生物合成等方面發(fā)揮重要作用,但在奶牛乳腺中FLCN的表達及其功能未見報道。本研究針對FLCN在細胞代謝、增殖、凋亡和信號轉(zhuǎn)導方面的功能以及相互作用蛋白進行分析,旨在揭示FLCN調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞增殖和乳蛋白合成的分子機理。實驗首先采用激光共聚焦檢測FLCN在青春期、泌乳期和干奶期奶牛乳腺組織中的表達,以鑒定FLCN在奶牛乳腺發(fā)育各時期的表達定位及表達差異。為確定FLCN對奶牛乳腺上皮細胞增殖和泌乳的作用,本實驗以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,對FLCN進行基因干擾和過表達調(diào)控,并采用 qRT-PCR 和 Western blot 檢測 AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、Caspase3和β-酪蛋白的表達,同時利用流式細胞儀檢測細胞增殖。實驗通過Co-IP和質(zhì)譜鑒定技術(shù)研究FLCN與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)的相互作用關(guān)系。為進一步確定FLCN對AMPK信號通路的調(diào)控作用,本研究對奶牛乳腺上皮細胞中FLCN基因進行過表達和干擾,并在培養(yǎng)基中分別添加AMPK激活劑和抑制劑,Western blot 檢測 FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1 和 β-酪蛋白的表達。實驗通過無糖培養(yǎng)基處理奶牛乳腺上皮細胞,并利用qRT-PCR和Western blot檢測無糖培養(yǎng)條件下 FLCN、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Cyclin D1、ACC 和 β-酪蛋白表達變化,研究FLCN對奶牛乳腺上皮細胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用。激光共聚焦檢測結(jié)果顯示FLCN主要定位于奶牛乳腺上皮細胞,并且在青春期和泌乳期乳腺組織中高表達,干奶期乳腺組織表達較低,說明FLCN可能參與奶牛乳腺發(fā)育和泌乳的調(diào)節(jié)。本實驗進一步檢測了 FLCN過表達和抑制對乳蛋白合成、細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示,FLCN過表達可以上調(diào)mTOR和β-酪蛋白的蛋白質(zhì)表達水平,并促進mTOR發(fā)生磷酸化,而抑制實驗結(jié)果與過表達相反。細胞活力檢測結(jié)果顯示,過表達FLCN使細胞數(shù)明顯增加,且細胞活力顯著增強。此外,過表達FLCN的乳腺上皮細胞增殖率顯著高于空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體組,且處于S期和G2-M期的細胞百分比均明顯升高,而G1期細胞百分比明顯下降。抑制實驗結(jié)果與過表達相反。過表達和抑制FLCN實驗還顯示FLCN正調(diào)節(jié)細胞周期蛋白Cyclin D1的表達,結(jié)合流式細胞儀的檢測結(jié)果說明FLCN促進細胞增殖。另外,結(jié)果顯示FLCN負調(diào)節(jié)凋亡蛋白Caspase3的表達,同時發(fā)現(xiàn)FLCN負向調(diào)控AMPK表達水平,并且抑制其磷酸化。以上實驗結(jié)果表明,FLCN正向調(diào)節(jié)mTOR的磷酸化水平從而促進乳蛋白合成和細胞增殖,抑制細胞凋亡,并且負調(diào)控AMPK。本實驗通過Co-IP和質(zhì)譜鑒定技術(shù)研究FLCN與AMPK的相互作用關(guān)系。結(jié)果顯示,當采用AMPK抗體進行Co-IP時,在IP產(chǎn)物中檢測到FLCN及其結(jié)合蛋白FINP1;采用FINP1抗體進行Co-IP時,在IP產(chǎn)物中檢測到AMPK和FLCN蛋白。結(jié)果表明FLCN及其結(jié)合蛋白FINP1與AMPK存在相互作用關(guān)系,提示FLCN參與AMPK信號通路的調(diào)節(jié)。本研究對奶牛乳腺上皮細胞中FLCN基因進行過表達和干擾,并在培養(yǎng)基中分別添加AMPK激活劑和抑制劑,進一步確定FLCN對AMPK信號通路的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,當AMPK激活時,FLCN蛋白表達升高,mTOR表達及磷酸化降低,Cyclin D1和β-酪蛋白的表達降低。AMPK活性抑制時結(jié)果相反。研究結(jié)果表明AMPK正調(diào)控FLCN的表達,負調(diào)控mTOR表達及活性,抑制乳蛋白合成和細胞增殖。結(jié)合之前的研究結(jié)果FLCN過表達抑制AMPK的表達及磷酸化,AMPK激活反而促進FLCN的表達,這樣AMPK與FLCN形成負反饋作用。本實驗又研究了 FLCN對奶牛乳腺上皮細胞乳腺能量代謝的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,無糖培養(yǎng)條件下AMPK和FLCN表達升高,AMPK磷酸化升高,乳蛋白合成通路重要調(diào)節(jié)蛋白mTOR表達和磷酸化降低,β-酪蛋白表達降低,乳脂合成相關(guān)酶ACC基因和蛋白表達降低。研究結(jié)果表明當乳腺上皮細胞能量缺乏時,細胞能量感受器AMPK被激活,抑制合成代謝,同時FLCN表達升高動態(tài)調(diào)節(jié)AMPK活性,抑制細胞凋亡,維持能量缺乏早期細胞存活。上述實驗證明FLCN通過AMPK信號通路參與奶牛乳腺上皮細胞的能量代謝調(diào)節(jié)。綜上所述,FLCN促進乳蛋白合成和細胞增殖,抑制細胞凋亡,并且FLCN參與乳腺上皮細胞中AMPK信號通路的調(diào)節(jié),FLCN與AMPK之間存在負反饋關(guān)系。
【圖文】：

Ｎｏｔｅ：邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｂ：邋ＣＫ１８邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ；邋ＤＡＰＩ－ｌａｂｅｌｅｄ邋ｎｕｃｌｅｉ邋（ｂｌｕｅ），邋ＦＩＴＣ－Ｉａｂｅｌｅｄ邋ＣＫ邋１８逡逑（ｇｒｅｅｎ）；邋ｓｃａｌｅ：邋３Ｏｆｉｍ逡逑圖３－３奶牛乳腺上皮細胞ＣＫ１８鑒定逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＫ１８邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑３．３邋ＦＬＣＮ對奶牛乳腺上皮細胞增殖、凋亡和乳蛋白合成的影響逡逑３．３．１邐ＦＺＣＷ干擾對奶牛乳腺上皮細胞增殖、凋亡和乳蛋白合成的影響逡逑３．３．１．１邐ＦＬＣ７Ｖ最佳干擾片段的篩選逡逑由上海吉瑪公司設(shè)計并合成ＦＬＣ７Ｖ基因干擾片段轉(zhuǎn)染到ＢＭＥＣｓ中，４８ｈ后收集細胞樣品，逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測各組樣品中ＦＬＣＷｍＲＮＡ表達，篩選出干擾效果最好的片段。結(jié)果如圖３－４所逡逑示，ｓｉＲＮＡ－２的干擾片段轉(zhuǎn)染后，凡ＣＷｒａＲＮＡ表達低于轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ－１和ｓｉＲＮＡ－３干擾片段，逡逑由此表明ｓｉＲＮＡ－２片段為最佳干擾片段可用于后續(xù)實驗。逡逑２邋１．５－．逡逑！邋°邋ｉ自逡逑ｉ：邋Ｊ邋Ｊ邋ｌｌ逡逑ＣＯＮ邋ｓｉＲＮＡ－１邋ｓｉＲＮＡ－２邋ｓｉＲＮＡ－３逡逑圖３－４ＦＬＣ７Ｖ最佳干擾片段的篩選；代表差異顯著（Ｐ＜０．０５）；邋“＊＊”代表差異極顯著逡逑（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．３－４邋Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｅｓｔ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ邋ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ＦＬＣＮ；邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ逡逑＜０．０５）；“＊＊”邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋

３．３．１．２轉(zhuǎn)染ＦＬＣＷ干擾片段逡逑轉(zhuǎn)染ＦＩＣＷ干擾片段并于６ｈ后在熒光顯微鏡下觀察。ＦＬＣＷ干擾片段具有ＦＡＭ綠色熒逡逑光基團，可在顯微鏡下觀察到綠色的熒光，由此可檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果如圖３－５所示，視野逡逑中綠色熒光分布廣泛，說明轉(zhuǎn)染成功效率較高，可用于后續(xù)實驗。逡逑圖３－５邋ＦＬＯＶ干擾片段的轉(zhuǎn)染效率逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＦＬＣＮ邋ｓｉＲＮＡ逡逑３．３．１．３邐ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測奶牛乳腺上皮細胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達逡逑實驗分為空白對照組（Ｂｌａｎｋ）、陰性對照組（ＮＣ）和／＝ＸＣＷ干擾組（ＦＩＣＷＫＤ）。轉(zhuǎn)染逡逑４８邋ｈ后，，收集細胞樣品。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測細胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相關(guān)基因的表達。實驗逡逑結(jié)果如圖３－６所示，與陰性對照組相比，ＦＬＣＷ干擾后Ｗ：ＣＷ、Ｃ＿ｙｃ／／？Ｄ／和（３－酪蛋白逡逑的ｍＲＮＡ表達降低，說明ＦＩＣ７Ｖ干擾后乳蛋白合成下降，細胞增殖減少。ＪＭＰ尺和逡逑的ｍＲＮＡ表達顯著升高，說明Ｆ￡ＣＷ干擾后細胞凋亡增加，尺表達受其調(diào)節(jié)。實驗結(jié)果逡逑表明，ＦＬＣ７Ｖ調(diào)控乳腺上皮細胞增殖、凋亡和乳蛋白合成。逡逑■Ｈ邋Ｂｌａｎｋ逡逑□邋ＮＣ逡逑２邋１，５１邐ｉｚａ邋ＦＩＸＮ邋ＫＤ逡逑ＩｋｆｌｌＭ逡逑ＦＬＣＮ邋ｍＴＯＲ邋ＡＭＰＫ邋ＣｖｃＩｉｎＤｌ邋｜Ｈ：ａ？ｅｉｎ邋ｃａＭｐａｓｅｉ逡逑圖３－６邋ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測細胞增殖、凋亡和乳蛋白合成相關(guān)基因表達；代表差異顯著逡逑（Ｐ＜０．０５）；邋“＊＊”代表差異極顯著（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．３－６邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823

【參考文獻】

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本文編號：2614639