【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的病原體之一,每年給全球養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,至今無有效的藥物。2006年,我國爆發(fā)了高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV),其毒力增強與RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp,nsp9)和解旋酶(Helicase,nsp10)的變異有關,但具體的分子機制尚不清楚。此外nsp9與nsp10是PRRSV復制轉(zhuǎn)錄復合體(RTC)最重要的組成部分,但其參與復制的分子機制仍未闡明。本研究通過晶體學方法解析了動脈炎病毒科PRRSV解旋酶的首個全長結(jié)構(gòu),揭示了一種1B結(jié)構(gòu)域走向不同的全新構(gòu)象,并首次展示了C末端結(jié)構(gòu)域的三維構(gòu)象。進一步通過生化實驗驗證了1B結(jié)構(gòu)域在解旋酶與核酸底物結(jié)合過程中發(fā)揮著重要的作用,及C末端結(jié)構(gòu)域?qū)TPase活性具有重要影響。本研究為闡釋nsp10參與病毒復制的分子機制及藥物設計提供了新思路。具體工作內(nèi)容如下:1.PRRSV nsp10結(jié)構(gòu)解析。原核表達純化PRRSV nsp10可溶性蛋白,通過晶體初篩及優(yōu)化獲得了高分辨率的晶體,并利用X-Ray衍射收集收據(jù)并解析了分辨率為3.0?的晶體結(jié)構(gòu)。PRRSV nsp10是由三個結(jié)構(gòu)域組成的單體:N端鋅指結(jié)構(gòu)域(ZBD)、非特征性1B結(jié)構(gòu)域及C端解旋酶核心結(jié)構(gòu)域。我們發(fā)現(xiàn)PRRSV nsp10 1B結(jié)構(gòu)域走向與其他解旋酶不同,將其與已有結(jié)構(gòu)的SF1家族解旋酶進行比較發(fā)現(xiàn)1B極具柔性且其在序列和結(jié)構(gòu)上的位置也有較大的變動,它并非是解旋酶必須存在的結(jié)構(gòu)域。我們從結(jié)構(gòu)上揭示了PRRSV nsp10 1B結(jié)構(gòu)域走向不同的原因在于1B上第126位亮氨酸(L)和第128位蘇氨酸(T)分別與ZBD上第19位丙氨酸(A)和第20位半胱氨酸(C)及1A結(jié)構(gòu)上第129位半胱氨酸(C)形成了氫鍵作用力。另外本文首次展示了動脈炎病毒科解旋酶C末端結(jié)構(gòu)域是由三個β-sheet和兩個相互垂直的α-helix組成,該規(guī)整性結(jié)構(gòu)提示了該區(qū)域在行使功能過程中可能發(fā)揮著重要作用。2.PRRSV nsp10 1B結(jié)構(gòu)域與C末端結(jié)構(gòu)域的功能研究。為了研究1B結(jié)構(gòu)域與C末端結(jié)構(gòu)域與功能的關系,我們構(gòu)建了nsp10Δ1B、nsp10 1-389重組質(zhì)粒,并純化了相應可溶性蛋白。首先利用EMSA方法檢測了nsp10Δ1B蛋白與dsDNA和dsRNA的結(jié)合力,結(jié)果表明nsp10Δ1B與dsDNA結(jié)合力相比于野生型蛋白降低了約50%;ATPase活性雖有所減弱但不會完全喪失;Helicase活性檢測結(jié)果表明1B缺失蛋白與野生型蛋白不存在顯著性差異,揭示了1B結(jié)構(gòu)域主要功能是與核酸底物的結(jié)合。同樣,為了研究nsp10 C末端結(jié)構(gòu)域與功能的關系,我們檢測nsp10 1-389蛋白的ATPase和Helicase活性,結(jié)果表明C末端結(jié)構(gòu)域的缺失完全喪失了ATPase的活性,但解旋功能幾乎不受影響。說明PRRSV nsp10 C末端結(jié)構(gòu)是ATPase活性發(fā)揮的必要組件。
【圖文】：

2圖 1.1 解旋酶的分類(Singleton et al 2007)Fig 1.1 The classification of Helicase認識 SF1、SF2 家族解旋酶，研究學者基于序列分1 家族解旋酶細分為三個家族 UvrD/Rep、Pif1-like 和九個家族 RecG-like、RecQ-like、Rad3/XPD、Ski2、DEAD-box、DEAH/RHA 和一個亞組 NS3/NPH-Ⅱ旋酶最經(jīng)典的解旋酶是真核生物解旋酶 Upf1，這類解旋：其一是 N 端具有非常保守的特征性結(jié)構(gòu)域：半胱），即鋅指結(jié)構(gòu)域（ZBD）。該區(qū)域不僅影響 ATPase2 的結(jié)合(Kadlec et al 2006, Chamieh et al 2008)。真核

豬繁殖與呼吸綜合征病毒解旋酶的結(jié)構(gòu)解析及功能研究管途徑可以快速檢測并降解含有 PTC 的 mRNA，，即無義 mRNA 降解途D 通路）(Isken and Maquat 2007)。在釀酒酵母和秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn) NMD心成分是 Upf1、Upf2 和 Upf3(Leeds et al 1992, Page et al 1999)，且 NMD 過步都需要 Upf1 解旋酶的參與（圖 1.3）。另一個保守結(jié)構(gòu)域是 C 端的 RecA-，這個結(jié)構(gòu)域包含了由 Walker Amotif 形成的磷酸鹽結(jié)合 loop（P-loop）以r B motif 形成參與 ATP 水解的精氨酸手指域(Gorbalenya and Koonin 1manya et al 1996, Korolev et al 1997)。除了這兩大保守的核心結(jié)構(gòu)外，Upf一般也包含輔助催化活性及與其他蛋白相互作用的其他配件結(jié)構(gòu)eton and Wigley 2002, Singleton and Dillingham 2007)。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 孫逸武,焦新福;解旋酶的結(jié)構(gòu)、功能與人類疾病[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;1998年06期

2 張榮紅;賈鐵文;廉芳;劉杰麟;周孟;;抗RecQ解旋酶單克隆抗體的制備、鑒定及應用[J];細胞與分子免疫學雜志;2018年02期

3 馬小彥;湯昌乾;薛朝琴;何媛;;RecQ解旋酶在維持基因穩(wěn)定性上的研究進展[J];飲食科學;2018年04期

4 陳靜;;再議遺傳信息的轉(zhuǎn)錄是否需要解旋酶[J];中學生物教學;2018年04期

5 雷迎峰,尹文,薛小平,楊敬,呂欣,韋三華,胡興斌,孫夢寧,徐志凱;丙型肝炎病毒解旋酶在大腸桿菌中的表達純化及鑒定[J];中國生物工程雜志;2005年09期

6 沈穎,明鎮(zhèn)寰;釀酒酵母中的RNA解旋酶[J];生命的化學;2001年01期

7 張正黎;蔡應繁;李文濤;常志超;朱小燕;;棉花解旋酶基因克隆及生物信息學分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2009年04期

8 徐國龍;;再議轉(zhuǎn)錄是否需要解旋酶[J];中學生物教學;2013年06期

9 張志亮;;DNA轉(zhuǎn)錄不需要單獨的解旋酶[J];中學教學參考;2013年11期

10 劉曉菊;;轉(zhuǎn)錄是否需要解旋酶[J];中學生物教學;2013年10期

相關會議論文 前10條

1 孫博;魏孔吉;李明;;用單分子磁鑷研究解旋酶UvrD的工作機理[A];第十一次中國生物物理學術大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

2 李健;胡斯奇;許豐雯;梅珊;金奇;梁臣;郭斐;;解旋酶SF1成員MOV10抑制流感病毒機制的初探[A];第九屆全國免疫學學術大會論文集[C];2014年

3 屈娥;郭紅蓮;孫博;李明;張道中;;光鑷研究UvrD解旋酶與DNA作用的動力學過程[A];第七屆全國光學前沿問題討論會論文摘要集[C];2007年

4 游慧娟;LattmannSimon;RhodesDaniela;嚴潔;;RHAU解旋酶水解ATP解鏈G-四鏈體DNA的工作機制的研究[A];中國化學會-生物物理化學專業(yè)委員會第四屆全國生物物理化學會議論文集[C];2016年

5 孫永梅;魏綠;席真;;人體RNA解旋酶A(RHA)各個結(jié)構(gòu)域與小分子及不同雙鏈RNA序列相互作用的研究[A];第八屆全國化學生物學學術會議論文摘要集[C];2013年

6 李明;龐哲;孫博;潘炳毅;竇碩星;;用單分子操縱和熒光技術研究解旋酶的工作機理[A];第七屆全國液體和軟物質(zhì)物理學術會議程序冊及論文摘要集[C];2010年

7 李明;龐哲;孫博;潘炳毅;竇碩星;;用單分子方法研究解旋酶的工作機理[A];第一屆全國生物物理化學會議暨生物物理化學發(fā)展戰(zhàn)略研討會論文摘要集[C];2010年

8 游慧娟;Simon Lattmann;Daniela Rhodes;嚴潔;;RHAU解旋酶水解ATP解開G-四鏈體機制的單分子研究[A];第十屆全國化學生物學學術會議報告摘要集（女性科學家論壇）[C];2017年

9 曹學濤;姚丹;李發(fā)弟;李萬宏;樂祥鵬;;綿羊DDX3Y基因表達鑒定及SNPs掃描[A];2017年全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學術研討會暨養(yǎng)羊?qū)W分會第七次全國會員代表大會論文集[C];2017年

10 劉珊珊;古勤生;;黃瓜綠斑駁花葉病毒的解旋酶區(qū)域與寄主因子的互作[A];河南省植物保護學會第十一次、河南省昆蟲學會第十次、河南省植物病理學會第五次會員代表大會暨學術討論會論文集[C];2017年

相關重要報紙文章 前3條

1 通訊員 靳瑩 田宏亮 記者 馮國梧;寨卡病毒解旋酶高分辨率晶體結(jié)構(gòu)揭示[N];科技日報;2016年

2 本報駐美國記者 王如君;獻身科學 造福人類[N];人民日報;2000年

3 ;二十九歲的輝煌[N];解放日報;2000年

相關博士學位論文 前10條

1 項念;DEAD-box RNA解旋酶DDX3抑制p65介導的NF-κB轉(zhuǎn)錄的機制研究[D];武漢大學;2016年

2 馬建兵;高精度單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究解旋酶的步進動理學[D];中國科學院大學(中國科學院物理研究所);2018年

3 林文霞;單分子研究Pif1解旋酶和shelterin對抗RPA機制[D];中國科學院大學(中國科學院物理研究所);2017年

4 陳偉飛;解旋酶DHX36解旋G-四鏈體結(jié)構(gòu)機理研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2017年

5 任華;RecQ解旋酶分子特性的研究[D];華東師范大學;2010年

6 丁秀艷;RecQ解旋酶的動力學機理研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2012年

7 秦魏;小分子化合物對RecQ解旋酶家族成員活性影響的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

8 肖慶利;家蠶桿狀病毒解旋酶基因啟動子結(jié)構(gòu)與功能分析及表達系統(tǒng)的應用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2002年

9 徐玲;大腸桿菌中二聚體DEAD-box RNA解旋酶CsdA結(jié)構(gòu)與功能的研究[D];中國科學技術大學;2017年

10 武文強;用單分子方法研究解旋酶與G4 DNA的作用機理[D];西北農(nóng)林科技大學;2017年

相關碩士學位論文 前10條

1 佟曉晗;豬繁殖與呼吸綜合征病毒解旋酶的結(jié)構(gòu)解析及功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2019年

2 張培培;基于依賴解旋酶恒溫擴增技術的研究與優(yōu)化[D];天津大學;2018年

3 楊霄云;寨卡病毒解旋酶水解機制的研究[D];天津大學;2018年

4 李康;黑腹果蠅DHX9解旋酶的蛋白表達以及活性分析[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

5 王賽楠;豬BLM解旋酶基因CDS區(qū)的克隆表達與功能分析[D];貴州大學;2019年

6 張升波;PRRSV貴州分離株GZZJ11、GZBJ12對解旋酶DDX6、Mov10的影響[D];貴州大學;2019年

7 田宏亮;寨卡病毒解旋酶的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];天津大學;2017年

8 秦燕;Deinococcus radiodurans RecD2解旋酶的原核表達純化與活性分析[D];西北農(nóng)林科技大學;2017年

9 許鑫;耐輻射球菌核酸解旋酶的初步研究[D];浙江大學;2013年

10 郭海磊;嗜熱菌Anaerobaculum hydrogeniformans Pif1解旋酶的表達純化及活性分析[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

本文編號：2611104