【摘要】：沙門菌是一種重要的食源性病原菌,絕大部分血清型對人和動物具有致病性,可引起多種不同臨床表現的沙門菌病。研究沙門菌感染宿主的致病機制對預防和控制沙門菌病具有重要現實意義。細菌非編碼小RNA(Small non-coding RNA,sRNA)是一類基因組中被轉錄但不編碼蛋白質的RNA分子,通過感應外界環(huán)境變化,在轉錄后水平快速調節(jié)基因表達。RyhB是存在于沙門菌、大腸桿菌等多種細菌中的一種sRNA。沙門菌編碼兩種RyhB同源物:RyhB-1和RyhB-2,二者可參與鐵代謝、能量代謝、硝酸鹽代謝、氧化應激、耐酸性、耐藥性等多種生命代謝過程的調控,但RyhB對毒力相關靶標基因的調控研究較少。本研究通過構建體外模擬腸道環(huán)境(Simulated Intestinal Environmentin vitro,SIE)模型,探究腸炎沙門菌在模擬腸道環(huán)境時RyhB的轉錄情況,篩選該條件下RyhB調控的毒力相關靶標基因,并對其調控機制及對宿主致病性作用進行深入研究。具體研究內容如下:1.低鐵、無氧和模擬腸道環(huán)境對RyhB-1和RyhB-2轉錄的影響缺氧和鐵匱乏是腸炎沙門菌及其它腸道菌感染宿主時必須面對的環(huán)境壓力。為研究低鐵、無氧和模擬腸道環(huán)境對RyhB轉錄的影響以及兩種RyhB同源物之間的轉錄關系,本研究檢測了腸炎沙門菌SE50336野生株、ryhB-1缺失株、ryhB-2缺失株、ryhB-1/ryhB-2雙缺失株在低鐵、無氧、模擬腸道環(huán)境下的生長情況,以及RyhB-1和RyhB-2的表達量。結果發(fā)現,與LB培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)條件下相比,低鐵、無氧條件和模擬腸道環(huán)境培養(yǎng)條件下,所有沙門菌菌株生長緩慢;相同培養(yǎng)條件下,ryhB單缺失或雙缺失均影響細菌生長。低鐵、無氧和模擬腸道環(huán)境均可誘導RyhB-1和RyhB-2的高轉錄,尤其是模擬腸道環(huán)境下,二者表達量與常規(guī)培養(yǎng)條件相比分別升高70、60倍,表明RyhB-1和RyhB-2在沙門菌適應以上不良環(huán)境中發(fā)揮重要作用;單一ryhB缺失可導致另一RyhB 同源物表達量增加,推測兩種RyhB同源物之間存在表達互補作用。2.模擬腸道環(huán)境下RyhB調控靶標基因的篩選為研究腸炎沙門菌自然感染宿主時RyhB的調控作用,通過轉錄組測序技術分析比較了模擬腸道環(huán)境條件下腸炎沙門菌野生株、ryhB-1缺失株、ryhB-2缺失株、ryhB-1/ryhB-2雙缺失株的轉錄組變化,以篩選模擬腸道環(huán)境條件下RyhB調控的靶標基因。轉錄組測序結果顯示,與野生株相比,ryhB-1、ryhB-2單缺失和雙缺失株中分別有496、250、553個差異表達基因(Different Expression Genes,DEGs),其中受RyhB-1和RyhB-2共同調控的靶基因有363個,受RyhB-1單獨調控的靶基因有188個,受RyhB-2單獨調控的靶基因有110個。挑選了 14個差異表達基因,利用熒光定量PCR技術驗證轉錄組測序結果的正確性。結果發(fā)現,熒光定量PCR檢測基因的表達量與轉錄組測序結果趨勢一致,表明轉錄分析數據可信度高,可繼續(xù)下一步分析。GO分析結果顯示,差異表達基因的分子功能主要富集到輔因子轉運活性、亞鐵血紅素轉運和ATP酶活性上,而生物過程和細胞組成主要富集到輔因子轉運、亞鐵血紅素轉運、蛋白質復合物生物合成與組裝等功能上。KEGG分析結果顯示,DEGs富集較多的通路包括硝酸鹽代謝通路、雙組份系統(tǒng)、信號轉導和細菌侵襲上皮細胞等毒力相關基因。3.RyhB-1和RyhB-2對毒力相關靶基因的調控作用機制研究轉錄組測序結果發(fā)現,模擬腸道環(huán)境條件下,RyhB-1和RyhB-2可上調編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白sipA和sopE基因的表達,抑制參與沙門菌在巨噬細胞內存活和復制的ssaI和sseA基因的表達。為進一步研究RyhB-1和RyhB-2對以上靶基因的調控機制,本研究通過生物信息學預測RyhB與上述靶基因的結合位點,利用雙質粒熒光報告系統(tǒng)證明調控機制(激活或抑制)。結果顯示,RyhB-1和RyhB-2可直接與sipA mRNA的5' UTR相互作用,使位于sipA mRNA 5' UTR上原本閉合的核糖體結合位點(Ribosome Bind Site,RBS)暴露出來,促進翻譯進程;RyhB-1和RyhB-2亦可直接與ssaI mRNA形成不完全互補配對,抑制ssaI翻譯。而RyhB-1和RyhB-2對sopE和sseA基因起間接調控作用。4.RyhB-1和RyhB-2調控沙門菌侵襲和胞內存活與復制為進一步探究模擬腸道環(huán)境下RyhB對宿主致病性調控作用,通過MEAT(Murine Ex vivo Anaerobic Tissue,MEAT model)模型證明ryhB缺失后,腸炎沙門菌對小鼠腸道上皮細胞侵襲能力減弱,推測在自然感染宿主后,RyhB-1和RyhB-2被誘導轉錄,通過與sipA mRNA 5' UTR相互作用,激活后者翻譯,影響腸炎沙門菌對上皮細胞侵襲能力。巨噬細胞內存活試驗表明,ryhB缺失導致腸炎沙門菌在巨噬細胞中存活能力減弱,但復制能力增強,推測RyhB-1和RyhB-2通過直接抑制參與腸炎沙門菌在巨噬細胞內存活與復制的效應蛋白SsaI表達,調控腸炎沙門菌在巨噬細胞內存活與復制。
【圖文】：

降低對細胞的損傷［９１］。而ＲｙｈＢ可調控ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋的比例起抗氧化應激作用。因逡逑為沙門菌兩種ＲｙｈＢ都參與調控與三羧酸循環(huán)相關蛋白（如編碼琥珀酸脫氫酶）逡逑的ｍＲＮＡ邋（圖１Ｃ）邋［５７，，９２］。研宄發(fā)現，Ｈ２０２作用后，沙門菌中的缺失可引起ＮＡＤＨ逡逑水平增加［９（）］。因此，推測ＲｙｈＢ通過調控電子通量平衡和細胞內Ｒ０Ｓ水平相關的基因表達逡逑起抗氧化應激作用。逡逑此外，／ｗｒ缺失株中，缺失可增強／ｗｒ缺失株抗Ｈ２０２的能力，表明ＲｙｈＢ－ｌ和ＲｙｈＢ－２逡逑抗氧化應激的作用受到Ｆｕｒ蛋白影響，推測與缺失引起含鐵蛋白表達下調，導致細胞逡逑內游離鐵含量增加有關［９３］。逡逑

邐陳斌杰：腸炎沙門菌非編碼�。遥危粒遥瑁抡{控毒力相關靶基因的篩選、鑒定和功能研究逡逑作用時（圖１－２Ｄ），ＷＴ生長更為緩慢，表明這兩種極端環(huán)境均不利于Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ生長。逡逑值得注意的是，無氧環(huán)境中ＷＴ生長較低鐵環(huán)境好，表明鐵元素缺失更不利于沙門菌生長。逡逑無論在無氧還是低鐵環(huán)境中，0；／出單基因缺失或雙基因缺失菌株均出現了一定程度生逡逑長缺陷，表明ｓＲＮＡ邋ＲｙｈＢ－１和ＲｙｈＢ－２在這兩種極端環(huán)境中對Ｓ．邋Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ生長具有重要逡逑影響。逡逑Ａ邋４，邐Ｂ邐＋邋ＷＴ逡逑＊邋ｎ邋ｈＨ￣Ｊ邋ｍｕｔａｎｔ逡逑ｙ邐？邐，邋ｆ邐ｎ邋ｈＢ－２邋ｍｕｔａｎｔ逡逑９邐00２邐，邋￡邐？邐ｎｈＢｓ邋ｎｎｉｌａｎｔ逡逑ｂ邐ｉ邋＊逡逑ｏ．ｉ＇邋／Ｆ逡逑：Ｚ＿＿＿邐ｊ逡逑0邋？邐？？邐？邐00０邋？邋Ｍ邋１８邐２４逡逑，＃１邐０邋２０－１逡逑Ｌ廣邐卜Ｚ逡逑Ｊ邐＿ｙ逡逑？邐？邋Ｕ邋Ｉｔ邋２４邐０邐？邐１２邐１？邐２４逡逑圖１－２．邋ＷＴ
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 黎劍華;夏偉;卓菲;楊貴清;;由腸炎沙門菌引起的食物中毒的調查分析[J];當代醫(yī)學;2016年36期

2 沈菁;從一例患兒血中分離出腸炎沙門菌[J];廣西預防醫(yī)學;2005年03期

3 金晶;;腸炎沙門菌不同檢測方法比較[J];中國校醫(yī);2018年02期

4 武國威,賈麗,李平;腸炎沙門菌致老年患者急性泌尿系統(tǒng)感染[J];齊魯醫(yī)學檢驗;2005年01期

5 鄭東宇;馬愷;周翌婧;唐震;;2012-2015年江蘇省食源性腸炎沙門菌同源性分析[J];江蘇預防醫(yī)學;2018年03期

6 蔣艷鳳;唐秀娟;蔣夙君;;一起腸炎沙門菌引起食物中毒的實驗室檢測[J];應用預防醫(yī)學;2017年02期

7 謝益君;陳米娜;金圓;徐景野;;腸炎沙門菌食物中毒調查與溯源報告[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2014年07期

8 劉南,曹俊杰,胡宏;分離腸炎沙門菌價廉有效的方法[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2000年06期

9 張海艷;周贊虎;胡元慶;劉斌;;腸炎沙門菌環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立[J];檢驗檢疫學刊;2017年06期

10 盛冬萍;劉安平;潘剛雷;陳米娜;楊元斌;徐景野;;一起腸炎沙門菌食物中毒報告[J];浙江預防醫(yī)學;2014年04期

相關會議論文 前8條

1 田文靜;廖成水;杜付玉;郁川;余祖華;張春杰;李銀聚;吳庭才;程相朝;;一株腸炎沙門菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息學分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物微生態(tài)學分會第五屆第十三次全國學術研討會論文集[C];2018年

2 王琳娜;;由腸炎沙門菌引起的食物中毒[A];2006中國微生物學會第九次全國會員代表大會暨學術年會論文摘要集[C];2006年

3 翟賢月;焦揚;孟闖;耿士忠;潘志明;焦新安;;減毒腸炎沙門菌C50336△sptP△rfbG缺失株的構建與鑒定[A];中國毒理學會獸醫(yī)毒理學委員會與中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)食品衛(wèi)生學分會聯合學術研討會暨中國毒理學會獸醫(yī)毒理學委員會第5次全國會員代表大會會議論文集[C];2017年

4 張麗娟;;腸炎沙門菌致小腿膿腫一例[A];第一次全國中西醫(yī)結合檢驗醫(yī)學學術會議暨中國中西醫(yī)結合學會檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

5 潘丹妮;劉勇;;腸炎沙門菌對喹諾酮類藥物耐藥性及耐藥機制研究[A];第一次全國中西醫(yī)結合檢驗醫(yī)學學術會議暨中國中西醫(yī)結合學會檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

6 曹俊;劉松艷;周薇;司微;王曼宇;張童利;劉思國;于申業(yè);;腸炎沙門菌延伸因子EF-Tu缺失株對環(huán)境壓力的應答變化[A];中國畜牧獸醫(yī)學會生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第十二次學術研討會論文集[C];2016年

7 沈麗珍;陳素菜;張愛鳴;張穎;林建芬;陳伊惠;;2010-2013年感染性腹瀉患者的細菌性病原構成及耐藥分析[A];紀念中國微生物學會臨床微生物學專業(yè)委員會成立五周年-第五屆中國臨床微生物學大會暨臺灣海峽兩岸微生物學與免疫學論壇論文匯編[C];2014年

8 朱春紅;孫曉慶;何素芬;朱國強;;基于Red同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構建腸炎沙門菌突變株方法的比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十四次學術研討會論文集[C];2008年

相關博士學位論文 前2條

1 焦揚;腸炎沙門菌rfbG、rfbH、avrA基因的功能及其分子機制研究[D];揚州大學;2019年

2 藺志杰;腸炎沙門菌效應蛋白AvrA參與宿主炎性反應機制[D];揚州大學;2017年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳斌杰;腸炎沙門菌非編碼小RNA RyhB調控毒力相關靶基因的篩選、鑒定和功能研究[D];揚州大學;2019年

2 朱悅;基于腸炎沙門菌CZ14-1的減毒疫苗候選株的構建與免疫保護效力的評價[D];揚州大學;2019年

3 蘇碩青;腸炎沙門菌nmpC基因缺失株的生物學特性及免疫效果分析[D];河北科技師范學院;2019年

4 強斌;基于全基因組重測序的腸炎沙門菌耐藥性研究[D];揚州大學;2018年

5 田雅楠;不同源腸炎沙門菌耐藥表型與耐藥基因型分析[D];揚州大學;2017年

6 李金鑫;不同地區(qū)沙門菌的流行病學調查及腸炎沙門菌SDBL-1分離株的致病性和傳播途徑探究[D];山東農業(yè)大學;2017年

7 陳韻;腸炎沙門菌轉錄因子SEN2967和SEN3610調控基因的篩選與鑒定[D];揚州大學;2017年

8 劉謝;廣東省2007-2013年腸炎沙門菌耐藥特征和分子分型研究[D];南方醫(yī)科大學;2015年

9 劉志成;利用IVIAT篩選腸炎沙門菌體內感染相關因子[D];揚州大學;2011年

10 任思琪;環(huán)丙沙星壓力下鼠傷寒和腸炎沙門菌的適應性研究[D];華南農業(yè)大學;2016年

本文編號：2599490