【摘要】：腺病毒是一種常用的研制重組病毒的載體,國內(nèi)外目前研究比較深入的是人和哺乳動物腺病毒載體,而對于禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)作為載體的研究較少。本研究擬分離鑒定血清1型禽腺病毒(FAdV-1),并對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究,為進(jìn)一步研制以FAdV為載體的重組病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。此外,還制備針對FAdV-1的單克隆抗體,為建立檢測FAdV-1的方法提供基礎(chǔ)材料。1.血清1型禽腺病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性分析本研究從健康雞群采集泄殖腔拭子,以FAdV通用引物Hex-F1/R1進(jìn)行PCR檢測。陽性樣品經(jīng)絨毛尿囊膜接種雞胚分離病毒,病毒在雞肝癌細(xì)胞系(LMH)上增殖培養(yǎng),直至產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變。在LMH細(xì)胞上增殖的病毒經(jīng)空斑純化,PCR鑒定并測序,序列經(jīng)比對分析確定病毒血清型,然后進(jìn)行生物學(xué)特性分析。我們從50份樣品中分離到一株FAdV-1,命名為FAdV-1 JS2017。病毒在LMH上可以產(chǎn)生細(xì)胞變圓,折光性增強(qiáng)的典型FAdV細(xì)胞病變。進(jìn)一步用SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測病毒滴度為6.34×107copies。經(jīng)電鏡觀察病毒粒子為球型、無囊膜,直徑為70～90 nm。設(shè)計34對引物,對JS2017全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增、測定及生物信息學(xué)分析,JS2017基因組全長為43739 bp,G+C含量為54.29%,包括34個ORF編碼區(qū),含有54 nt的末端倒置重復(fù)序列(ITR)。JS2017與FAdV-1參考毒株CELO株、61/11Z株、JM1/1株、W-15株同屬一個大的進(jìn)化分支,核苷酸序列同源性分別為99.3%、99.7%、99.3%、99.6%。一周齡SPF雞通過肌肉注射106.86TCID50 JS2017病毒液進(jìn)行人工致病性試驗,試驗雞未出現(xiàn)任何明顯臨床癥狀。感染10d后進(jìn)行剖檢,喉頭、氣管、心臟、肝臟、肌胃、腎臟等內(nèi)臟器官未發(fā)現(xiàn)肉眼可見病變。組織病理學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)各臟器組織結(jié)構(gòu)無明顯異常。排毒檢測結(jié)果表明,感染7d達(dá)到排毒高峰,并且在肝臟、腎臟中也能夠檢測到病毒。這些結(jié)果表明FAdV-1 JS2017株無致病性,復(fù)制能力強(qiáng)。在FAdV-1 JS2017株基因組右末端40000 bp～43620 bp的復(fù)制非必需區(qū)兩端設(shè)計引物擴(kuò)增同源臂,通過帶有同源臂序列和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFAd1-EGFP與FAdV-1 JS2017株在LMH細(xì)胞內(nèi)同源重組,缺失掉同源臂序列之間的復(fù)制非必需區(qū)而替換為EGFP基因的完整表達(dá)盒。FAdV-1 JS2017株感染LMH細(xì)胞2h后,轉(zhuǎn)移載體pFAd1-EGFP通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞,并用空斑純化的方法純化重組病毒,成功獲得了一株穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組病毒FAd1-EGFP,該結(jié)果表明缺失FAdV-1 JS2017株基因組右末端復(fù)制非必需區(qū),不影響其在LMH細(xì)胞上的穩(wěn)定復(fù)制,為進(jìn)一步研制以FAdV為載體的重組病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。2.FAdV-1單克隆抗體的制備在LMH細(xì)胞上增殖FAdV-1JS2017,收取病毒液,初步純化后免疫BALB/c小鼠�？贵w效價達(dá)到1:25600,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合。JS2017病毒液經(jīng)超速離心純化后作為抗原包被酶標(biāo)板,利用建立的間接ELISA方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆后雜交瘤細(xì)胞的檢測,獲得9株針對FAdV-1的雜交瘤細(xì)胞株。用原核表達(dá)的FAdV-1六鄰體蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板,對9株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行鑒定,得到5株針對FAdV-1六鄰體蛋白能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2D11、3C7、6G8、9D6、12H7。進(jìn)一步經(jīng)純化的FAdV-4和FAdV-8b分別作為抗原,通過間接ELISA、間接免疫熒光試驗、Westem-blot對上述5株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示6G8和9D6能夠與FAd V-4和FAdV-8b發(fā)生特異性反應(yīng)。本研究獲得5株能穩(wěn)定分泌抗FAdV-1六鄰體蛋白的單克隆抗體,其中6G8和9D6同時與FAdV-1、FAdV-4和FAdV-8b發(fā)生特異性反應(yīng),這些單抗為以后建立檢測FAdV-1的方法提供基礎(chǔ)材料。
【圖文】：

邐Ｘｔ—Ｎｏｔｌ逡逑、ＸｈｏＩ逡逑圖１－２轉(zhuǎn)移載體ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ結(jié)構(gòu)示意圖逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑

邐Ｍ邋ＤＯＷＮ逡逑￣＾０１逡逑圖１－１轉(zhuǎn)移載體Ｐ－ＵＤ的示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐ－ＵＤ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑２．４．１．３．３質(zhì)粒ｐ－ＵＤ的酶切鑒定逡逑質(zhì)粒ｐ－ＵＤ分別用／／／ｗ／ＩＩＩ、Ｉ和ＡＷ邋Ｉ、Ｉ進(jìn)行雙酶切，然后經(jīng)１％瓊脂糖凝膠逡逑電泳進(jìn)行鑒定，與凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。逡逑２．４．２轉(zhuǎn)移載體ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ的構(gòu)建及鑒定逡逑２．４．２．１轉(zhuǎn)移載體ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ的構(gòu)建逡逑將雙酶切鑒定正確的ｐ－ＵＤ和ｐＢ－ＥＧＦＰ邋（本實驗室保存）經(jīng)Ａ／0／Ｉ邐限制性內(nèi)切逡逑酶分別進(jìn)行雙酶切，３７°Ｃ水浴鍋中反應(yīng)１邋ｈ，，邋１％凝膠電泳后切膠回收。將回收的ｉＶｏ／１－ＥＧＦＰ－逡逑Ａｒ丨１片段，與線性化載體ｐ－ＵＤ用Ｔ４邋ＤＮＡ連接酶２５°Ｃ連接２邋ｈ。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Ｔｒａｎｓ－逡逑Ｔ１感受態(tài)細(xì)胞，涂Ａｍｐ＋板子，３７°Ｃ培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。挑取５個單菌落分別接種予５逡逑ｍＬ含Ａｍｐ＋的ＬＢ液體培養(yǎng)基中，２２０邋ｒ／ｍｉｎ，３７°Ｃ搖床振蕩過夜。以ＣＭＶ－Ｆ、ＢＧＨ－Ｒ為逡逑引物，菌液ＰＣＲ鑒定陽性克隆。鑒定正確的陽性菌液按丨：１００的比例接種于１５邋ｍＬ含有逡逑Ａｍｐ＋的ＬＢ液體培養(yǎng)基中
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2593310