【摘要】：內(nèi)臟脂肪素(visfatin)是脂肪細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種細(xì)胞因子,并能夠通過內(nèi)分泌或旁分泌的方式運(yùn)輸?shù)狡渌M織器官,參與機(jī)體的免疫、炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝平衡。在脂肪組織中,visfatin在調(diào)控脂肪代謝的過程中發(fā)揮著重要作用,然而visfatin在山羊中的相關(guān)研究未見報(bào)道,同時(shí)關(guān)于visfatin在脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究也較少。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因,是脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。因此,研究PPARγ與visfatin的作用關(guān)系有助于進(jìn)一步揭示PPARγ在山羊脂肪細(xì)胞代謝過程中的作用機(jī)制。本研究首先分離克隆得到山羊visfatin基因,然后通過qPCR分析其在不同組織和脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式。此外,利用油紅O染色來觀察脂肪細(xì)胞分化過程中脂滴的變化以及羅格列酮(rosiglitazone)對(duì)脂肪細(xì)胞分化的作用。進(jìn)一步,分離克隆得到山羊visfatin基因啟動(dòng)子序列,構(gòu)建了visfatin基因啟動(dòng)子的缺失載體,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和ChIP分析了visfat n基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.本實(shí)驗(yàn)克隆獲得了山羊的visfatin基因,位于山羊基因組的4號(hào)染色體上,其開放閱讀框(ORF)大小為1476bp,編碼的氨基酸數(shù)目為491個(gè)。氨基酸序列與牛、豬、鼠的相似性分別達(dá)到了 99%、98%和98%。分析其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn),visfatin具有典型的PBEF蛋白結(jié)構(gòu)域,是PRTase-typeⅡ超家族的一員。2.組織表達(dá)分析表明:visfatin基因在腎臟中表達(dá)量最高,顯著高于其他組織(P0.01),其次在腦和皮下脂肪組織表達(dá)量也相對(duì)較高,而在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低。3.通過油紅O染色和甘油三酯的測(cè)定可知,在脂肪細(xì)胞分化的過程中,脂滴的積累和甘油三酯的含量不斷增多。在分化的早期,脂滴數(shù)量較少,體積較小。隨著分化的進(jìn)行,脂滴逐漸增多,同時(shí)小脂滴逐漸融合,形成了體積較大的大脂滴。甘油三酯的含量從第0天到第4天相對(duì)較低,第6天到第10天顯著增加(P0.01),第10天達(dá)到峰值。此外,rosiglitazone處理促進(jìn)了山羊脂肪細(xì)胞的分化,前體脂肪細(xì)胞在分化的第8天和第10天顯著增加甘油三酯的含量(p0.01)。4.通過qPCR檢測(cè)山羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中visfatin和PPARγ的表達(dá)規(guī)律及rosiglitazone處理對(duì)其表達(dá)的影響。visfatin在分化的第0天到第6天逐漸升高,第6天達(dá)到最大值后開始降低,第10天時(shí)表達(dá)量降到最低。PPARy從第0天到第4天呈現(xiàn)升高的趨勢(shì),在第4天時(shí)達(dá)到最大值,之后逐漸降低。Rosiglitazone對(duì)visfatin和PPARγ的表達(dá)均有顯著影響。在第0天和第2天,rosiglitazone促進(jìn)了 visfatin的表達(dá),第2天達(dá)到顯著差異(P0.05);而從第4天開始對(duì)visfatin的表達(dá)具有抑制作用,第4天達(dá)到顯著水平(P0.05),在第6天和第10天時(shí)達(dá)到了極顯著水平(P0.01)。Rosiglitazone能夠促進(jìn)PPARy的表達(dá),在第2天到第6天具有顯著差異(P0.01),而在其他階段差異不顯著。5.在山羊前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中,GSK3β調(diào)控山羊PPARγ和visfatin基因的表達(dá)。和對(duì)照組相比,過表達(dá)GSK3β顯著降低了 visfatin基因的表達(dá)(P0.05),但顯著增加了 PPARγ基因的表達(dá);反之,SB216763處理后,visfatin基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高,而對(duì)PPARy的表達(dá)有顯著的抑制作用(P0.05)。6.利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)visfatin啟動(dòng)子活性,結(jié)果表明:-735/+34片段的啟動(dòng)子活性顯著高于-1624/+34和-486/+34的活性。通過對(duì)visfatin基因啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)在-735/+34片段中包含有一個(gè)PPARγ結(jié)合的位點(diǎn)。將此結(jié)合位點(diǎn)突變后,其啟動(dòng)子活性顯著降低(P0.01)。同時(shí),rosiglitazone處理后的結(jié)果表明,visfatin基因-735/+34片段的啟動(dòng)子活性被顯著抑制(P0.01),而PPARγ結(jié)合位點(diǎn)突變的啟動(dòng)子片段活性沒有受到影響。rosiglitazone對(duì)前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中visfatin的mRNA水平都具有顯著的抑制效果(P0.05),表明PPARγ能夠抑制visfatin的表達(dá)。7.ChIP實(shí)驗(yàn)證明PPARy能夠與visfatin的啟動(dòng)子結(jié)合,rosiglitazone處理使與visfatin啟動(dòng)子結(jié)合的PPARγ減少。和對(duì)照組相比,過表達(dá)GSK3β減少了與visfatin啟動(dòng)子結(jié)合的PPARy蛋白,而SB216763處理增加了 PPARy與visfatin啟動(dòng)子的結(jié)合。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了 GSK3β能夠通過PPARy調(diào)控visfatin的轉(zhuǎn)錄。
【圖文】：

的人，其ｍＲＮＡ表達(dá)量顯著增加［４９］。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)血漿加的水平顯著升高，可促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展Ｍ５１］。在炎性條件下〃的水平與炎癥和疾病活動(dòng)的程度相關(guān)，是晚期全身炎癥反應(yīng)的介質(zhì)［５癌、直腸癌和惡性膠質(zhì)瘤等癌細(xì)胞中，ｖｆｅ／加如的表達(dá)上調(diào)［５３邋５４＼有研，在Ｉ和ＩＩ型糖尿病患者中，Ｖ／球勵(lì)２水平均有增加，肥胖患者的Ｖ／喊勵(lì)７ｍＲＮＡ水平均低于對(duì)照組［５５，邋５６］。逡逑邋ｖｉｓｆａｔｉｎ基因的作用機(jī)制逡逑在脂肪組織中，肥胖可以減少Ｗ＋破治《表達(dá)從而降低ＮＡＤ＋含量，，降低的合成和X椉佑衛(wèi)脛舅幔ǎ疲疲粒┑牟�，同时可以綑n透臥嗪凸趨蘭〉囊刃�，减少概P嗪凸腔砑〉奶譴唬郟常叮蕁４送�，ＮＡＤ＋的含量綑n禿�，曳N疲鋇幕钚裕傭種屏隋蔚娜ヒ陰；賈擄咨咀櫓厴�，素祿垂｀P玻丁保擔(dān)罰蕁ｅ義希希猓澹螅椋簦義

本文編號(hào)：2593022