【摘要】：山羊奶富含短、中鏈脂肪酸以及多種不飽和脂肪酸。乳中短、中鏈脂肪酸(C8-C14)和部分長(zhǎng)鏈脂肪酸(C16)主要由乳腺上皮細(xì)胞從頭合成,而長(zhǎng)鏈脂肪酸(C16及以上)主要通過(guò)外源吸收獲得。反10、順12共軛亞油酸(t10c12-CLA)是反芻動(dòng)物瘤胃微生物代謝的中間產(chǎn)物,在碳鏈第10位和第12位形成共軛雙鍵的十八碳烯酸,具有降低乳脂合成的作用,可抑制山羊乳腺短、中鏈脂肪酸的合成,然而目前t10c12-CLA調(diào)控脂肪酸的分子機(jī)制尚不明確。通過(guò)研究t10c12-CLA調(diào)控山羊乳腺上皮細(xì)胞脂代謝分子機(jī)理,對(duì)調(diào)控羊奶中脂肪酸成分和含量,改善羊奶風(fēng)味以及提高羊奶品質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。本研究通過(guò)日糧添加t10c12-CLA飼喂泌乳期西農(nóng)薩能奶山羊,構(gòu)建體外乳腺上皮細(xì)胞t10c12-CLA處理模型,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),細(xì)胞功能和形態(tài)學(xué)研究,基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè),基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的探索,以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究手段,探究了t10c12-CLA對(duì)山羊乳脂代謝的影響及分子調(diào)控機(jī)制,獲得如下結(jié)果:1.t10c12-CLA對(duì)奶山羊泌乳性能的影響選擇30只西農(nóng)薩能奶山羊經(jīng)產(chǎn)母羊,按體重和產(chǎn)奶量分為3組,每組10只。分別飼喂0、8 g/d(CLA-1組)和16 g/d(CLA-2組)的脂包被的共軛亞油酸(LE-CLA),結(jié)果表明,試驗(yàn)組與對(duì)照組相比產(chǎn)奶量、乳糖和乳蛋白變化不顯著(P0.05);乳脂肪含量顯著降低(P0.05)。兩個(gè)試驗(yàn)組中短中鏈脂肪酸(C16)含量均顯著下降,且CLA-1和CLA-2組差異顯著(P0.05);C16:0和C16:1含量在CLA-2組中顯著下降(P0.05),而長(zhǎng)鏈脂肪酸(C16)在各組間差異均不顯著(P0.05)。飽和脂肪酸(SFA)和不飽和脂肪酸(UFA)含量分別隨著CLA飼喂?jié)舛鹊脑黾佣@著降低和升高(P0.01)。CLA-2組C16和C18去飽和指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P0.01)。2.t10c12-CLA對(duì)山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMECs)生長(zhǎng)的影響對(duì)體外培養(yǎng)的GMECs外源添加不同濃度的t10c12-CLA,通過(guò)細(xì)胞活力、hoechst33342染色、實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)、western blot以及細(xì)胞劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),100μM濃度的t10c12-CLA處理GMECs后細(xì)胞增殖未受到影響,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡,但對(duì)細(xì)胞遷移表現(xiàn)出抑制作用。200μM濃度的t10c12-CLA處理GMECs不超過(guò)12 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖未造成影響,但超過(guò)12 h時(shí)可明顯抑制細(xì)胞增殖。3.t10c12-CLA處理GMECs的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)與生物信息學(xué)分析對(duì)體外培養(yǎng)的GMECs外源添加0、100μM和200μM濃度t10c12-CLA(分別命名為CTR、TR1和TR2組),提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行RNA-seq分析。使用山羊基因組(Capra hircus genome,ID:10731)作為參考基因組,注釋到轉(zhuǎn)錄本一共25153條,以RPKM0.01作為基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn),CTR、TR1和TR2組分別有17559、17455和17982個(gè)基因表達(dá)。以校正后的P值0.05作為差異基因的閾值,TR1 vs.CTR,TR2 vs.CTR和TR1vs.TR2分別有49、854和623個(gè)差異基因。通過(guò)對(duì)差異基因組共有的41個(gè)差異基因進(jìn)行GO和KEGG顯著性富集分析發(fā)現(xiàn),所富集到的細(xì)胞信號(hào)通路大多數(shù)與脂代謝相關(guān)。通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果可靠,同時(shí)發(fā)現(xiàn)ACSL4、FDPS、HMGCS1、PLIN2、SCD1和SLC2A1基因表達(dá)水平隨著t10c12-CLA處理濃度增加而發(fā)生明顯變化,呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)效應(yīng)(P0.05)。4.t10c12-CLA影響GMECs脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)體外培養(yǎng)的GMECs外源添加100μM濃度t10c12-CLA,通過(guò)油紅O染色、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸成分測(cè)定、RT-qPCR、western blot、免疫熒光染色等技術(shù)手段研究發(fā)現(xiàn),t10c12-CLA能夠抑制脂肪酸從頭合成和去飽和過(guò)程,而長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)攝取和脂滴形成相關(guān)過(guò)程被激活,胞漿脂滴的積累增加。通過(guò)熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),t10c12-CLA抑制了SREBP1和SCD1基因的啟動(dòng)子活性;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SCD1基因啟動(dòng)子核心區(qū)域SRE位點(diǎn)活性也被t10c12-CLA抑制。5.t10c12-CLA通過(guò)AMPK和mTOR通路調(diào)控GMECs脂代謝的分子途徑對(duì)體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞外源添加100μM、200μM濃度t10c12-CLA研究發(fā)現(xiàn),t10c12-CLA能夠顯著降低mTOR磷酸化水平,增加AMPK磷酸化水平。Akt/mTOR通路特異性抑制劑MK-2206和Rapamycin,以及AMPK通路抑制劑Dorsomorphin處理GMECs后,Akt/mTOR通路和AMPK通路分別受到影響;抑制劑和t10c12-CLA共同處理GMECs發(fā)現(xiàn),t10c12-CLA可負(fù)調(diào)控Dorsomorphin對(duì)ACACA和SCD1基因表達(dá)的上調(diào)作用;Rapamycin和t10c12-CLA對(duì)SREBF1表達(dá)的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。綜上所述,t10c12-CLA對(duì)奶山羊乳脂代謝具有重要的調(diào)控作用,不僅降低山羊乳脂率和短中鏈脂肪酸含量,而且抑制GMECs脂肪酸從頭合成和去飽和化過(guò)程,并通過(guò)SREBP1調(diào)控SCD1基因的轉(zhuǎn)錄;同時(shí)通過(guò)影響AMPK和mTOR的激酶活性調(diào)控乳脂代謝網(wǎng)絡(luò)。
【圖文】：

圖 1-1 動(dòng)物出生后乳腺的發(fā)育（引自 Macias and Hinck, 2012）Figure 1-1 The stages of postnatal mammary gland development (Macias and Hinck, 2012)乳腺上皮中主要存在兩種細(xì)胞類(lèi)型：基質(zhì)上皮和腔上皮。基質(zhì)上皮由肌上皮細(xì)胞組成，形成腺體外層；腔上皮細(xì)胞形成導(dǎo)管和分泌腺泡。與肌上皮相結(jié)合，腔上皮生成兩層狀的管狀上皮結(jié)構(gòu)，在哺乳時(shí)外部肌上皮細(xì)胞收縮，將來(lái)自腺泡腔細(xì)胞的乳汁擠壓出來(lái)(Macias and Hinck, 2012)。乳腺產(chǎn)奶量主要取決于以下幾個(gè)因素：乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量、增殖、凋亡細(xì)胞比例的變化(Sordillo et al., 1984, Capuco et al., 2003)；上皮細(xì)胞的分泌能力和活力、細(xì)胞分化程度(Akers et al., 2006)；和乳腺血管運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝能力、血管發(fā)生情況(Djonov et al., 2001)。不同泌乳時(shí)期能夠影響乳腺細(xì)胞的數(shù)量和分泌活性。在泌乳盛期和中期，乳腺上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的分泌能力。對(duì)乳腺組織形態(tài)學(xué)觀察表明，不同泌乳時(shí)期乳腺有著明顯的差異，而且在泌乳初期和中期分化更加明顯，具有最大的腺泡截面積；在泌乳初期到中期，乳腺上皮細(xì)胞增加 12%，泌乳量增加 51.3%；而在泌乳中期到后期，乳腺上皮細(xì)胞減少 35.9%，泌乳量下降 71.4% (Elsayed et al., 2009)。1.2 乳脂代謝的調(diào)控

a2+信號(hào)和的鈣調(diào)蛋白依賴(lài)型蛋白激酶（calmodulin-dependent protein K）調(diào)節(jié)，在這些細(xì)胞中 CaMKKβ 主要負(fù)責(zé)激活 Thr172(Hawley et al., 2005005)。β-亞基的主要功能是作為結(jié)合 α 和 γ-亞基的支架，形成功能性 AM。而 γ-亞基主要作為腺苷酸結(jié)合區(qū)域，在低能量條件下，ADP 或 AMP 含量 ADP 與 γ-亞基結(jié)合能夠改變 AMPK 構(gòu)象，促進(jìn) Thr172 磷酸化(Xiao et al.,MPK 激活后，能夠直接磷酸化一些與能量代謝和生長(zhǎng)相關(guān)的重要下游底能夠持續(xù)改變代謝的編程基因表達(dá)(Mihaylova and Shaw, 2011)，，使合成代代謝活動(dòng)減弱，ATP 生成和機(jī)體的某些分解代謝增強(qiáng)。此外，AMPK 還可力傳感器參與 DNA 損傷反應(yīng)途徑(Sanli et al., 2013)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S827

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2588594