發(fā)布時間：2019-10-24 06:25

【摘要】：傳統(tǒng)抗生素的濫用，臨床上多種耐藥菌株、超級細(xì)菌等的出現(xiàn)，對畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及人類健康造成了極大的威脅。研制高效廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性，且對機(jī)體低毒甚至無毒的新型抗菌藥物，以替代傳統(tǒng)抗生素，成為一項迫切的任務(wù)。在開發(fā)新型抗菌藥物的過程中，，抗菌肽以其廣譜的抗菌活性進(jìn)入人們的視野，并逐漸成為研究的熱點。抗菌肽是生物體在抵抗外來微生物入侵時產(chǎn)生的一類防御性小肽，是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性好，抗菌機(jī)理獨特，對臨床耐藥細(xì)菌具有廣譜的抗菌活性，且不易誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等特點。隨著研究的進(jìn)一步深入，人們還發(fā)現(xiàn)抗菌肽不僅具有良好的抗菌活性，還表現(xiàn)出良好的抗病毒、抗真菌、選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長等生物活性，并且對動物體的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。 本研究中，以本課題組由牛紅細(xì)胞血紅蛋白α亞基中分離到的抗菌肽P3為研究對象。通過對其進(jìn)行氨基酸序列分析、分子設(shè)計等，以提高其殺菌活性，并對其溶血性、細(xì)胞毒性、特異性選擇抑制Hela細(xì)胞活性進(jìn)行分析。通過CD掃描，對P3進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；采用膜滲透性、掃描電鏡觀察、膜電位檢測等試驗，對P3的膜破壞機(jī)制進(jìn)行初步的探索。分析P3進(jìn)入細(xì)胞后對細(xì)胞內(nèi)液中鈣離子濃度平衡的干擾作用。結(jié)合P3的膜-肽作用機(jī)制，以闡明P3的殺菌機(jī)制。并通過構(gòu)建ICR小鼠感染模型，對P3及其類似物在小鼠體內(nèi)的抗感染活性進(jìn)行研究。 為了增強(qiáng)P3的抑菌活性，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計了四條P3類似物序列，分別命名為JH-0、JH-1、JH-2、JH-3。與P3相比，四種類似物對五種測試菌株的MIC值均有不同程度的升高，且溶血性、細(xì)胞毒性較小，其中JH-3對癌細(xì)胞Hela表現(xiàn)出良好的選擇性抑制活性。膜-肽作用機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)：P3在細(xì)菌磷脂膜模擬環(huán)境下，自身形成α-螺旋結(jié)構(gòu)；P3作用于細(xì)菌后，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性增加，并在細(xì)胞膜表面形成孔洞樣結(jié)構(gòu)、區(qū)域性裂解，對細(xì)胞膜的生理結(jié)構(gòu)形成物理性損傷，并造成細(xì)胞生理性膜電位的去極化。同時P3進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起胞漿內(nèi)的鈣震蕩，造成鈣超載。P3通過對細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)多樣化的作用方式最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。 ICR小鼠體內(nèi)毒性試驗發(fā)現(xiàn)：P3及其類似物在小鼠體內(nèi)的LD50均高于臨床常用藥物PMB，而且小鼠對腹腔注射時抗菌肽的吸收率優(yōu)于皮下注射。P3及其類似物對臨床耐藥菌感染ICR小鼠的保護(hù)率均大于60%，其中JH-3對感染小鼠的保護(hù)率高達(dá)90%，而Amp組和空白組的小鼠在20h內(nèi)全部死亡。并且在注射后2h，P3及其類似物可有效降低小鼠血液中的菌落含量，以JH-3組差異極其顯著。該研究表明：P3及其類似物對耐藥菌感染小鼠表現(xiàn)出良好的抗感染能力。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述成分子內(nèi)二硫鍵，使其二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn) β-折疊結(jié)構(gòu)。這類抗菌肽主要包括植物蟲、哺乳動物類的防御素以及富含脯氨酸的抗菌肽。（3）線性結(jié)構(gòu)抗菌肽，如圖 1-1（C）。這類抗菌肽缺少二級結(jié)構(gòu)，一級中多含有某一種或幾種氨基酸，如牛嗜中性粒細(xì)胞抗菌肽 Indolicidin，由 1氨基酸組成，其中含有 5 個色氨酸。

圖2-2 P3和JH-3對E. coli ATCC 25922 (A), an E. coli clinical strain (B), C. albicans ATCC90029(C), and C. albicans clinical strain(D) (6×105CFU/mL)在2×MIC濃度下作用不同時間的實時殺菌動力學(xué)Figure 2-2 Bacterial survival after treatment with peptides. The killing kinetics of P3 and JH-3. E.coli ATCC 25922 (A), an E. coli clinical strain (B), C. albicans ATCC90029 (C), and C. albicans(D) (6×105CFU/mL) were exposed to P3 and JH-3 at 2×MIC for 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, and 60min.3.3 對正常體細(xì)胞的細(xì)胞毒性許多研究發(fā)現(xiàn)，部分天然抗菌肽在發(fā)揮抑菌活性的同時，對正常的體細(xì)胞并不具有細(xì)胞毒性[54]。雖然目前關(guān)于抗菌肽作用機(jī)制尚不明確，但是高效抗菌，并對正常體細(xì)胞低毒、無毒的特性，必然會是抗菌肽在未來得到進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用的一獨特優(yōu)勢。本研究選取紅細(xì)胞、HaCaT 兩種細(xì)胞為代表，以分析 P3 及其類似物對哺乳動物正常體細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為 P3 及其類似物的后續(xù)研究、開發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。3.3.1 溶血性
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S859.79

【共引文獻(xiàn)】

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4 陳

本文編號：2552428