【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疫病,是禽類疫病中危害最為嚴重的烈性傳染性疫病之一,目前我國新城疫病毒流行的主要毒株是基因Ⅶ型新城疫病毒。該病毒主要保護性抗原為病毒表面的血凝素-神經氨酸酶(HN)蛋白和融合(F)蛋白。其中,HN蛋白是主要的宿主保護性蛋白和病毒的毒力蛋白,能侵染細胞并能夠誘導機體產生中和抗體,兼具有血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)兩種活性。鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis,DVE)是由鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的一種的急性、熱性和敗血性傳染疫病。該病毒基因組較大可容納多個外源基因的插入且感染宿主范圍較窄,只感染鴨、鵝等雁形目禽類而不感染雞。另外,該病毒可以產生快速免疫保護,具有作為疫苗活載體的優(yōu)勢。目前,對于新城疫和鴨病毒性腸炎這兩種疫病的防控主要依賴疫苗接種,包括弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗激發(fā)機體產生抗體應答快速,但容易受母源抗體的干擾;滅活疫苗能夠產生持久的免疫保護,但是刺激機體產生抗體較慢。因此有必要研制新型基因工程疫苗以彌補上述兩種疫苗的不足。經本課題組前期研究證明:TK基因和US10基因都是病毒的復制非必需基因,缺失后不影響病毒的復制,因此可以作為外源基因的插入位點。不僅如此,TK基因是病毒的主要毒力基因,缺失后病毒的毒力降低但免疫原性不變,該基因已逐漸成為構建新型基因缺失疫苗的首選靶基因。故本研究選擇鴨腸炎病毒TK基因作為外源基因的插入位點,以實驗室已構建的r DEV TK-EGFP為親本病毒,采用同源重組技術構建表達新城疫病毒HN蛋白的重組鴨腸炎病毒r DEV TK-HN,并對其進行基因水平、蛋白水平的鑒定。利用新城疫病毒HN基因特異性引物PCR檢測到大小約為1.7 kb的HN基因插入,Western blot檢測到大小為74 k D的新城疫病毒HN蛋白的表達,間接免疫熒光檢測在綠色熒光視野下可見帶綠色熒光的蝕斑,這些都表明HN基因已經準確插入到重組病毒TK基因位置并可以穩(wěn)定表達。對該重組病毒的復制動力學檢測表明與親本病毒相比,該重組病毒的毒力略有下降,但是總體趨勢仍保持一致。該重組病毒經雞胚成纖維細胞(CEF)和SPF雞胚分別連續(xù)傳代20代后,每五代進行基因和蛋白水平的檢測,PCR都可以檢測到約為1.7 kb的NDV HN基因插入,Western blot都可以檢測到74 k D的NDV HN蛋白的表達,間接免疫熒光檢測在綠色熒光視野下都可見帶綠色熒光的蝕斑,這些證實了HN基因可以隨病毒復制而穩(wěn)定遺傳并表達,說明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。在成功構建重組鴨腸炎病毒r DEV TK-HN的基礎上,以該重組病毒為親本病毒,在US10基因位置插入EGFP報告基因構建TK基因和US10基因雙缺失的重組鴨腸炎病毒r DEV TK-HN\US10-EGFP。經兩代蝕斑純化后PCR鑒定表明EGFP基因已插入到鴨腸炎病毒US10基因位置,但是該重組病毒不能穩(wěn)定傳代,表明TK基因和US10基因雙缺失在一定程度上影響病毒的復制。該重組病毒沒有純化完全,仍需要設計更優(yōu)化的實驗方法進一步純化該重組病毒。該重組病毒為構建TK基因和US10基因雙缺失表達新城疫病毒主要保護性抗原HN蛋白和F蛋白的重組鴨腸炎病毒奠定基礎,以期研制出高效的新城疫新型基因工程疫苗,對新城疫和鴨病毒性腸炎的防控具有重要意義。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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