發(fā)布時(shí)間：2019-05-31 13:08

【摘要】：赫曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是毒性最大、產(chǎn)毒量最高、對(duì)農(nóng)產(chǎn)品污染最重的赫曲霉毒素,它廣泛存在于糧食、飼料和糧谷類食物等中。OTA具有腎毒性、肝毒性、致畸性、基因毒性、胚胎毒性等。OTA對(duì)家禽的毒性較強(qiáng),主要引起肝臟損傷,但目前多集中于肝損傷癥狀報(bào)道,機(jī)理研究較少。因此,研究OTA致雞肝細(xì)胞損傷病理機(jī)制及護(hù)肝藥物修復(fù)效應(yīng),具有重要的理論和實(shí)踐意義。本文藉體外雞原代肝細(xì)胞,研究OTA致雞肝細(xì)胞損傷病理演變及常用護(hù)肝藥的修復(fù)效應(yīng)及機(jī)理。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1 OTA誘導(dǎo)雞原代肝細(xì)胞損傷最佳劑量的篩選采用改良的二步Ⅳ型膠原酶循環(huán)灌流法,對(duì)40-50日齡海藍(lán)公雞進(jìn)行肝細(xì)胞的分離培養(yǎng),待培養(yǎng)24h后,細(xì)胞貼壁。在貼壁細(xì)胞中分別加入0(對(duì)照組)、0.25、0.5、1、2、4 μg/mLOTA(n=3),繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后,光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),取肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液,檢測(cè)其中ALT、AST的含量,MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示:對(duì)照組細(xì)胞貼壁牢固,呈多角形,核圓透亮,細(xì)胞聚集成島嶼狀生長(zhǎng),排列整齊。試驗(yàn)組細(xì)胞隨著OTA濃度的增大,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,密度下降,部分肝細(xì)胞破裂、壞死懸浮于培養(yǎng)基中,剩余細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散破碎。細(xì)胞存活率和ALT、AST的含量呈劑量依賴性的下降和上升。當(dāng)細(xì)胞中加入1 μg/mL OTA培養(yǎng)24 h后,肝細(xì)胞存活率為51.33 ±4.27%,細(xì)胞上清液中ALT含量極顯著升高(P0.01),AST含量顯著升高(P0.05)。當(dāng)OTA為2、4 μg/mL時(shí),細(xì)胞上清液中ALT、AST含量均極顯著升高(P0.01),細(xì)胞存活率較低;而0.25 μg/mLOTA組,與對(duì)照組相比,ALT、AST的含量均無(wú)顯著性差異。故選擇OTA濃度1 μg/mL作為致雞肝細(xì)胞損傷的最佳劑量。2 OTA對(duì)雞原代肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡的研究取正常培養(yǎng)24 h的細(xì)胞,OTA組中更換含有11μg/mL OTA的培養(yǎng)基(n=3),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞。檢測(cè)各組細(xì)胞中SOD的活性、GSH和MDA的含量,測(cè)定細(xì)胞凋亡率及線粒體途徑相關(guān)基因Caspase-3,Bax,bxl-2的表達(dá)量。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,1μg/mL OTA可使細(xì)胞中SOD的活性和GSH的含量極顯著下降(P0.01),MDA的含量極顯著升高(P0.01),表明OTA可造成肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率發(fā)現(xiàn),OTA組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.01),可達(dá)32.06±2.11%(正常組細(xì)胞凋亡率為1.80±0.45%)。OTA組中Caspase-3,Bax表達(dá)量極顯著上升(P0.01),Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P0.05),表明OTA可能是誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡。3復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對(duì)OTA致肝細(xì)胞損傷保護(hù)效應(yīng)3.1復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯對(duì)肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用取正常培養(yǎng)24h細(xì)胞,設(shè)置對(duì)照組,OTA致?lián)p組和四種護(hù)肝藥物高中低劑量組(0.1、1、10 μg/mL)(n=3)。先加入護(hù)肝藥物預(yù)處理,然后加入OTA繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,檢測(cè)其中ALT、AST含量,MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率,以此研究四種護(hù)肝藥物對(duì)肝細(xì)胞膜的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,與OTA組相比,復(fù)方甘草酸單胺組和葡醛內(nèi)酯組隨藥物濃度的增大,細(xì)胞存活率升高,ALT的含量下降(P0.01),呈現(xiàn)劑量依賴性。但復(fù)方甘草酸單胺各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST的含量均無(wú)顯著變化,但整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),葡醛內(nèi)酯則可使AST顯著下降(P0.01),但各濃度組之間變化趨勢(shì)無(wú)規(guī)律可循。L-精氨酸組和水飛薊素組與OTA組相比,細(xì)胞存活率升高明顯,ALT含量顯著下降(P0.01),但在低濃度下保護(hù)效果較好。水飛薊素組中AST含量顯著下降(P0.01),但變化無(wú)規(guī)律,L-精氨酸組則是在1 μg/mL濃度下,AST含量下降最明顯(P0.05)。此結(jié)果表明,復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素和葡醛內(nèi)酯均有保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用。3.2復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)酯的抗氧化作用取正常培養(yǎng)24h細(xì)胞,設(shè)置對(duì)照組,OTA致?lián)p組和1 μg/mL復(fù)方甘草酸單胺組、1 μg/mL L-精氨酸組、1 μg/mL水飛薊素組、1 μg/mL葡醛內(nèi)酯組(n=3)。預(yù)先加入護(hù)肝藥物處理,再加入1 μg/mL OTA繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集各組細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性和GSH、MDA的含量。結(jié)果顯示,與OTA組相比,四種護(hù)肝藥物組均可升高SOD活性和GSH含量,降低細(xì)胞中MDA含量(P0.05),其中尤以水飛薊素作用效果最好,此可表明四種護(hù)肝藥物均可通過(guò)抗氧化作用來(lái)抑制OTA導(dǎo)致的肝損傷。3.3復(fù)方甘草酸單胺、L-精氨酸、水飛薊素、葡醛內(nèi)醋對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組,OTA致?lián)p組和1 μg/mL復(fù)方甘草酸單胺組、1 μg/mLL-精氨酸組、1 μg/mL水飛薊素組、1 μg/mL葡醛內(nèi)酯組(n=3)中細(xì)胞的調(diào)亡率,熒光定量PCR檢測(cè)線粒體調(diào)亡途徑相關(guān)基因Caspase-3,Bcl-2,Bax的表達(dá)。結(jié)果顯示,與OTA組相比,經(jīng)四種護(hù)肝藥物預(yù)處理后,細(xì)胞凋亡率下降顯著(P0.05),尤以水飛薊素和復(fù)方甘草酸單胺抑制凋亡作用明顯。四種護(hù)肝藥均可在一定程度上降低Caspase-3,升高Bcl-2的表達(dá),但L-精氨酸和葡醛內(nèi)酯對(duì)Bax的表達(dá)量無(wú)明顯降低作用,表明復(fù)方甘草酸單胺和水飛薊素可能是通過(guò)抑制線粒體途徑的凋亡來(lái)達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞的作用,而L-精氨酸和葡醛內(nèi)酯則可通過(guò)改變Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2489719