發(fā)布時(shí)間：2019-02-18 22:49

【摘要】：骨骼肌是機(jī)體運(yùn)動(dòng)的主要執(zhí)行者及代謝活動(dòng)的主要調(diào)控因子,其生長發(fā)育主要受一系列轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳調(diào)控因子的調(diào)控。mircoRNA長度為18-24個(gè)核苷酸,通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明,mircoRNA在骨骼肌的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。通過mircoRNA測(cè)序分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-432-5p在35日齡仔豬的背最長肌中的表達(dá)水平顯著高于在287日齡成年榮昌豬的表達(dá)水平,差異高達(dá)7倍;且miR-432在小鼠、人和豬等不同物種中高度保守。基于此,本研究以C2C12成肌細(xì)胞系為研究材料,旨在探索miR-432在骨骼肌成肌細(xì)胞增殖與分化中的作用及調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-432模擬物(mimics)或miR-432抑制物(inhibitor),研究了miR-432對(duì)成肌細(xì)胞增殖和分化的作用;運(yùn)用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn),預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-432的靶基因,進(jìn)一步探索了miR-432調(diào)控成肌細(xì)胞增殖與分化的分子機(jī)制。獲得如下主要結(jié)果:1.miR-432抑制成肌細(xì)胞的增殖在成肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-432可以顯著下調(diào)增殖相關(guān)基因Cyclin E,PCNA和CDK2mRNA與蛋白表達(dá)水平,并顯著下調(diào)S期的細(xì)胞數(shù)及總的細(xì)胞數(shù)目;相反,抑制miR-432后促進(jìn)了成肌細(xì)胞的增殖過程。2.miR-432抑制成肌細(xì)胞的分化過表達(dá)miR-432后可以顯著抑制分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MyoG和標(biāo)志基因MyHC mRNA和蛋白表達(dá)水平;通過免疫熒光染色技術(shù),發(fā)現(xiàn)miR-432能顯著抑制肌管的形成并下調(diào)分化指數(shù)。3.miR-432直接靶定E2F3和P55PIK構(gòu)建野生型及突變型雙熒光素酶報(bào)告載體后,miR-432能顯著抑制E2F3和P55PIK野生型熒光素酶活性,而不影響其突變型熒光活性。不同濃度的mimics處理成肌細(xì)胞后,E2F3和P55PIK的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴式下降。4.miR-432通過抑制P55PIK介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR通路抑制成肌細(xì)胞的分化過表達(dá)miR-432能顯著下調(diào)分化期的p-Akt/t-Akt及p-mTOR/t-mTOR比值,但不影響增殖期的p-Akt/t-Akt及p-mTOR/t-mTOR比值。當(dāng)加入低濃度的胰島素(insulin)后,miR-432對(duì)分化的抑制作用被削弱,而加入高濃度的insulin后能基本消除miR-432對(duì)分化的抑制作用。本研究基于miRNA測(cè)序,解析了我國西部地區(qū)肉質(zhì)優(yōu)良地方品種榮昌豬的肌肉發(fā)育特性,發(fā)現(xiàn)miRNA-432-5p在35日齡榮昌豬背最長肌的表達(dá)顯著高于287日齡,進(jìn)一步研究表明該miRNA靶向E2F3和P55PIK,并通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制成肌過程。研究結(jié)果為探索我國地方豬品種肉質(zhì)優(yōu)良特性的非編碼RNA調(diào)控提供了新的候選基因,也為豬優(yōu)良肉品質(zhì)性狀選育提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Skeletal muscle is the main executor of body movement and the main regulator of metabolic activity. The growth and development of skeletal muscle are mainly regulated by a series of transcription factors and epigenetic regulators. The length of mircoRNA is 18-24 nucleotides. The expression of target gene was regulated at post-transcriptional level by binding to 3 'untranslated region (3'UTR) of target gene mRNA. MircoRNA plays an important role in skeletal muscle development. By mircoRNA sequencing, we found that the expression level of miR-432-5p in the longissimus dorsi muscle of 35-day-old piglets was significantly higher than that in 287-day-old Rongchang pigs, and the difference was as high as 7 times. MiR-432 is highly conserved in different species, such as mice, humans and pigs. Therefore, the purpose of this study was to explore the role of miR-432 in the proliferation and differentiation of skeletal myoblasts and its regulatory mechanism. The effects of miR-432 on the proliferation and differentiation of myoblasts were studied by transfection of miR-432 mimics (mimics) or miR-432 inhibitor (inhibitor), into myoblasts. The target genes of miR-432 were predicted and verified by bioinformatics and double luciferase report test. The molecular mechanism of miR-432 regulating the proliferation and differentiation of myoblasts was further explored. The main results were as follows: 1.miR-432 inhibited the proliferation of myoblasts and overexpression of miR-432 in myoblasts could significantly down-regulate the expression levels of proliferation-associated genes Cyclin, CDK2mRNA and protein. The number of S phase cells and the total number of cells were significantly down-regulated. On the contrary, inhibition of miR-432 promoted the proliferation of myoblasts. 2.miR-432 inhibited the over-expression of miR-432 in myoblasts and significantly inhibited the expression of MyoG, the marker gene MyHC mRNA and protein. Immunofluorescence staining showed that miR-432 could significantly inhibit the formation of myotubes and down-regulate the differentiation index. 3.miR-432 directly targeted E2F3 and P55PIK to construct wild-type and mutant double-luciferase report vectors. MiR-432 significantly inhibited the activity of E2F3 and P55PIK wild-type luciferase, but did not affect its mutant fluorescence activity. The myoblasts were treated with different concentrations of mimics. The expression of mRNA in E2F3 and P55PIK decreased in a concentration-dependent manner. 4.miR-432 could significantly down-regulate p-Akt/t-Akt and P in differentiation phase by inhibiting P55PIK mediated PI3K/Akt/mTOR pathway to inhibit myoblast differentiation and overexpression of miR-432. -mTOR/t-mTOR ratio, However, the ratio of p-Akt/t-Akt and p-mTOR/t-mTOR in proliferative stage was not affected. When low concentration of insulin (insulin) was added, the inhibitory effect of miR-432 on differentiation was weakened, but the inhibitory effect of miR-432 on differentiation was basically eliminated by adding high concentration of insulin. Based on miRNA sequencing, the muscle development characteristics of Rongchang pig with good meat quality in western China were analyzed. It was found that the expression of miRNA-432-5p in the longissimus dorsi muscle of 35 day old Rongchang pig was significantly higher than that of 287-day old Rongchang pig. Further studies showed that the miRNA targeted E2F3 and P55 Pi, and inhibited myogenesis through PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. The results provided a new candidate gene for exploring the non-coding RNA regulation of the fine meat quality of local pig breeds in China, and provided scientific basis for the breeding of good meat quality traits of pigs.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

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