發(fā)布時(shí)間：2018-11-26 18:02

【摘要】：雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的,嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要的病毒性傳染病之一。因?yàn)镮BV血清型眾多,且不同的血清型之間的交叉保護(hù)力弱,給疫病的防控帶來了極大的困難。目前IB的預(yù)防措施主要還是依賴于疫苗接種,生產(chǎn)中常采用的是弱毒苗和弱毒苗,弱毒苗存在毒力返祖和自然散毒的隱患,滅活疫苗雖然安全性好,但是其免疫保護(hù)效果維持時(shí)間短,需要多次注射免疫,所需的成本較高。核酸疫苗具有安全性好和誘導(dǎo)全方位的免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn),而IBV的表面纖突(S)蛋白基因是最重要的免疫原性蛋白,能誘導(dǎo)良好的保護(hù)性免疫,它又分為S1和S2 2個(gè)亞單位,其中S1蛋白是決定IBV特異性抗原決定簇的主要蛋白。M基因相對而言保守性較高,與病毒復(fù)制有關(guān),且其可能存在具有免疫作用的抗原決定簇。因此,研制IBV表位核酸疫苗這種新型基因工程疫苗,對防制IBV具有重要的意義。本研究應(yīng)用篩選出的IBV毒株的結(jié)構(gòu)蛋白基因S1基因的T細(xì)胞抗原表位盒和B細(xì)胞抗原表位盒,酶切連接入真核表達(dá)載體pVAX,構(gòu)建7組表位核酸疫苗,研究其免疫保護(hù)效力。分別利用前期篩選出的IBV的結(jié)構(gòu)蛋白基因S1全基因、S1基因的T細(xì)胞抗原表位盒和結(jié)構(gòu)蛋白M全基因,構(gòu)建3組真核表達(dá)質(zhì)粒:pVAX-S1、pVAX-S1T+M、pVAX-S1+S1T+M;IBV的結(jié)構(gòu)蛋白基因S1基因的T細(xì)胞抗原表位盒、Australia T株和M41株的S1基因的B細(xì)胞抗原表位,構(gòu)建4組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S1B(M41)、pVAX-S1B(T)、pVAX-S1T+S1B(M41)、pVAX-S1T+S1B(T);將原有的質(zhì)粒S1B(T)、S1T重新設(shè)計(jì)引物,改造酶切位點(diǎn)重新連接構(gòu)成pVAX-S1BT+S1T。將每組提取制備的質(zhì)粒溶液通過腿部肌肉多點(diǎn)注射的方式免疫7日齡SPF雛雞,28日齡加強(qiáng)免疫一次。同時(shí)設(shè)立PBS組作為對照組。分別在首免前及免疫后的7d、14d、21d以及二免后的7d每組隨機(jī)抽取3只雞,翅靜脈采血并分離血清,用間接ELISA方法檢測特異性抗體水平。二免后第10d用劑量10~6ELD_(50)/只的IBV病毒液滴鼻點(diǎn)眼攻毒,通過保護(hù)率和排毒量檢測的結(jié)果這兩個(gè)指標(biāo)來評價(jià)疫苗的保護(hù)效果�？贵w效價(jià)結(jié)果顯示:pVAX-S1、pVAX-S1T+M組與PBS組相比差異顯著(p0.05);pVAX-S1B(T)、pVAX-S1T+S1B(M41)和pVAX-S1T+S1B(T)組與PBS組相比差異均顯著(p0.05);pVAX-S1B(T)、pVAX-S1B+S1T組與PBS組相比差異均顯著(p0.05)。攻毒結(jié)果表明,疫苗免疫組pVAX-S1和pVAX-S1T+M免疫后,有效誘導(dǎo)了雞體的免疫反應(yīng),分別能提供80%(8/10)和70%(7/10)的保護(hù)率;疫苗組pVAX-S1、pVAX-S1T+M、pVAX-S1B(T)免疫后,其保護(hù)率明顯增高,分別為75%(6/8)、62.5(5/8)和75%(6/8);疫苗組pVAX-S1B(T)、pVAX-S1B+S1T免疫后,提供的保護(hù)效力分別為84.7%(11/13)和69.3%(9/13)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)表明篩選的IBV表位抗原成分能夠有效發(fā)揮保護(hù)效力,為研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途徑。
[Abstract]:Avian infectious bronchitis (Infectious bronchitis,IB) is one of the most important viral infectious diseases, which is caused by (Infectious bronchitis virus,IBV (avian infectious bronchitis virus). Because of the numerous serotypes of IBV and the weak cross-protection between different serotypes, it is very difficult to prevent and control epidemic diseases. At present, the preventive measures of IB mainly depend on vaccine inoculation. The attenuated vaccine and attenuated vaccine are often used in production. The attenuated vaccine has the hidden danger of virulence atavism and natural dispersal, although the inactivated vaccine is safe, However, the protective effect of immune protection is short and requires multiple injections of immunization, which requires high cost. Nucleic acid vaccine has the advantages of good safety and comprehensive immune response. The surface fibrin (S) protein gene of IBV is the most important immunogenicity protein, it can induce good protective immunity, and it can be divided into S1 and S2 subunits. S1 protein is the main protein that determines the specific antigen determinant of IBV. M gene is relatively conservative and related to virus replication, and it may have an immunological determinant. Therefore, the development of IBV epitope nucleic acid vaccine, a new genetic engineering vaccine, is of great significance to the control of IBV. In this study, the T cell epitope box and B cell antigen epitope box of S1 gene of structural protein gene of IBV strain were selected and ligated into eukaryotic expression vector pVAX, to construct 7 groups of epitope nucleic acid vaccine. Three groups of eukaryotic expression plasmids were constructed by using the whole S1 gene of IBV, the T cell epitope box of S1 gene and the whole gene of structural protein M, respectively. Three groups of eukaryotic expression plasmids were constructed: pVAX-S1,pVAX-S1T MVAX-S1 S1T M; Four groups of eukaryotic expression plasmids, pVAX-S1B (M41), pVAX-S1B (T), pVAX-S1T S1B (M41), were constructed from T cell epitope box, Australia T strain of S1 gene of IBV and B cell epitope of S1 gene from M41 strain. PVAX-S1T S1B (T); The primer was redesigned from the original plasmid S1B (T), S1T, and the restriction site was reconnected to form pVAX-S1BT S1T. SPF chicks of 7 days old were immunized with plasmid solution extracted from each group by multi-point injection of leg muscle, and the chickens were immunized once at 28 days of age. At the same time, PBS group was established as control group. Three chickens were randomly selected from each group on day 21 and day 7 respectively before immunization and 7 days after immunization. Blood samples were collected from wing vein and serum was isolated. Specific antibody levels were detected by indirect ELISA method. On the 10th day after the second immunization, the protective effect of the vaccine was evaluated by the protective rate and the results of the detoxification test with the dose of 10 ~ 6ELD _ (50) / mouse IBV. The results of antibody titer showed that there were significant differences between pVAX-S1,pVAX-S1T M group and PBS group (p0.05), pVAX-S1B (T), pVAX-S1T S1B (M41) and pVAX-S1T S1B (T) group compared with PBS group (p0.05). There were significant differences between pVAX-S1B (T), pVAX-S1B S 1 T group and PBS group (p 0. 05). The results showed that pVAX-S1 and pVAX-S1T M could effectively induce the immune response of chicken body, which could provide 80% (8 / 10) and 70% (7 / 10) protective rates, respectively. The protective rate of pVAX-S1,pVAX-S1T MVAX-S1B (T) was 75% (6 / 8), 62.5% (5 / 8) and 75% (6 / 8) respectively. The protective effects of pVAX-S1B (T), pVAX-S1B S1T were 84.7% (11 / 13) and 69.3% (9 / 13), respectively. In conclusion, this study shows that the selected IBV epitope antigen can effectively exert the protective effect, and provide a new way for the development of safe and effective new IBV vaccine.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.31

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