本文選題：瘤胃上皮細胞 + 生物鐘基因��； 參考：《揚州大學》2017年碩士論文

【摘要】：生物鐘基因廣泛存在于哺乳動物的細胞中,胃腸道內也存在生物鐘基因的表達,且能夠影響胃腸道內營養(yǎng)物質的吸收轉運、以及轉運蛋白的表達。本課題組前期研究發(fā)現,不同周齡湖羊瘤胃上皮組織的生物鐘基因均能夠表達。揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)作為瘤胃內發(fā)酵的主要產物和反芻動物的主要能量來源,且VFA能通過轉運蛋白以吸收進入瘤胃上皮細胞。為此,本論文旨在初步探討在瘤胃上皮細胞的揮發(fā)性脂肪酸吸收與其生物鐘因子表達的關系。研究主要包括以下部分:試驗一、山羊瘤胃上皮原代細胞的分離培養(yǎng)與生物鐘蛋白的免疫熒光鑒定試驗通過連續(xù)0.25%胰蛋白酶消化法分離瘤胃上皮原代細胞,并使用顯微鏡觀察細胞形態(tài)、免疫熒光法鑒定細胞角蛋白18的表達、CCK8法(Cellcounting8)測定細胞活性,體外添加15mmol/L 丁酸鈉測定瘤胃上皮細胞代謝丁酸的生物功能。同時,使用免疫熒光法鑒定山羊瘤胃上皮細胞的CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白的表達。分析結果:原代培養(yǎng)的瘤胃上皮細胞形態(tài)學上呈鋪路石狀分布,細胞生長曲線呈“S”型,符合上皮細胞的典型的形態(tài)和生長曲線。同時,細胞能夠陽性表達細胞角蛋白18,使用含有15mmol/L的丁酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h能夠極顯著提高培養(yǎng)液中β-羥丁酸的產量(P0.01),符合瘤胃上皮細胞的生物學功能,且體外瘤胃上皮細胞能夠陽性表達CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白,存在生物鐘蛋白的表達。試驗二、不同揮發(fā)性脂肪酸對瘤胃上皮細胞增殖活性和吸收速率的影響試驗通過體外添加15 mmol/LVFA處理瘤胃上皮細胞包括乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉處理細胞6、12、24h,使用CCK8法測定各組細胞活力,并且使用液相色譜儀測定培養(yǎng)液中的VFA濃度。VFA處理24h后使用流式細胞術測定細胞周期,同時,使用RT-PCR法測定細胞周期基因的表達。結果發(fā)現:1)對照組的細胞活力顯著或極顯著高于VFA處理組(P0.05或P0.01)。丙酸組的細胞活力在12h和24h極顯著高于乙酸組和丁酸組(P0.01)。2)通過細胞周期的分析,VFA處理組的細胞處在G1期的比例極顯著高于對照組,且乙酸組和丁酸組極顯著高于丙酸組(P0.01)。3)細胞處理24 h后,處理液中丙酸組的丙酮酸濃度極顯著高于其他組(P0.01),丁酸組極顯著高于對照組和乙酸組(P0.01)。4)相比于對照組,VFA處理極顯著的抑制CCND1、CCNB1和CDK1和CDK2的相對表達(P0.01),且能夠下調CDK4的表達,但是差異不顯著(P0.05)。5)不同VFA的吸收速率丁酸組最高,丙酸組次之,乙酸組最慢((P0.01),且培養(yǎng)液中的VFA濃度隨著培養(yǎng)時間的延長而極顯著下降(P0.01)。試驗三、瘤胃上皮細胞揮發(fā)性脂肪酸吸收蛋白和生物鐘因子表達的相關性研究試驗通過體外添加15 mmol/LVFA處理瘤胃上皮細胞包括乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉處理細胞6 h、12 h、24h,研究不同VFA對細胞生物鐘和VFA吸收基因表達、以及基因表達的相關性的影響�；蛳鄬Ρ磉_量通過RT-PCR法測定,基因表達量的相關性分析使用皮爾森相關分析進行。結果發(fā)現:1)VFA對于瘤胃上皮細胞生物鐘基因和吸收基因表達有不同程度的影響,VFA處理極顯著抑制Clock基因表達、而極顯著提高Bmal1基因和Per2基因的表達(P0.01),丁酸組的Per3基因極顯著高于其他組(P0.01)。丙酸組和丁酸組的Cry2極顯著高于對照組和乙酸組(P0.01)。VFA能夠顯著提高NR1D1和RORa的基因表達,降低NR2F2、FBXW11的相對表達(P0.05),而對NCOR1沒有顯著影響(P0.05)。2)VFA處理對PPAR家族的基因表達存在不同的影響,丙酸組和丁酸組能夠極顯著上調PPARA的表達(P0.01),丙酸組的PPARD和PPARG的表達量顯著高于對照組(P0.05)。3)VFA處理能夠極顯著提高PAT1,降低MCT1和MCT4基因的表達(P0.01),而對NHE1沒有顯著的影響(P0.05)。此外,不同VFA對于AE2、VH+ATPase的表達影響不一致。4)MCT1和MCT4基因表達與生物鐘因子存在極顯著的相關性(P0.01),Bmal1和PAT1的表達顯著相關(P0.05)。且生物鐘因子的表達與CCND1、CCNB1、CDK1和CDK2存在顯著的正相關或者負相關(P0.05)。綜上,1)使用0.25%胰蛋白酶連續(xù)消化、培養(yǎng)的瘤胃上皮細胞符合上皮細胞的形態(tài)、免疫化學、增殖活性的特點、并且具有相關的生物學功能,證明該細胞為山羊瘤胃上皮細胞。且瘤胃上皮細胞在體外能夠陽性表達CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白。2)VFA能夠通過下調細胞周期蛋白以及CDK的基因表達,影響細胞G0/G1期向S期轉變,從而抑制瘤胃上皮細胞DNA合成、并降低細胞增殖活力。不同VFA在體外吸收速率存在差異。3)VFA對瘤胃上皮細胞的生物鐘基因和吸收基因有不同程度的影響,生物鐘基因的表達與細胞周期基因以及VFA吸收基因的表達存在相關性。
[Abstract]:In this paper , we studied the expression of biological clock gene in rumen epithelial cells by continuous 0.25 % trypsin digestion method . The results showed that : 1 ) The cell viability of rumen epithelial cells was significantly higher than that in VFA group ( P0.05 or P0.01 ) . Conclusion : 1 ) VFA can significantly increase the expression of the gene of the cell cycle protein and the expression of the gene , but also significantly improve the expression of the expression of the gene and the expression of the gene in the control group ( P0.01 ) .

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.2

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本文編號：1732676