發(fā)布時間：2018-03-16 08:26

  本文選題：綿羊　切入點：體外受精　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：體外受精技術(shù)作為胚胎工程研究領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù),廣泛地應(yīng)用于家畜繁殖領(lǐng)域,為家畜遺傳保種等提供了技術(shù)保障。綿羊是我國重要的家畜之一,也是家畜體外受精最早研究的動物,但其體外受精效率卻明顯低于其他家畜。除此之外,干細胞在家畜領(lǐng)域具有非常大的潛在應(yīng)用價值。綿羊類干細胞的體外培養(yǎng),不僅可以作為研究哺乳動物發(fā)育的體外模型,也可以用于治療和育種,應(yīng)用前景廣闊,但目前綿羊干細胞的研究仍處于起步階段。溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid,LPA)是一種小分子甘油磷脂,在多種動物細胞中具有生長因子和激素樣活性。LPA通過結(jié)合其耦聯(lián)G蛋白的各種受體,激活下游多條信號通路,產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),如促進細胞增殖、分化、遷移、侵襲、黏附和形態(tài)發(fā)生等。有研究表明,LPA可促進卵母細胞成熟,提高胚胎發(fā)育率,對細胞增殖有促進作用。通過在體外受精及囊胚接種細胞培養(yǎng)過程中添加LPA,探究LPA對綿羊體外受精的促進機制以及囊胚接種細胞培養(yǎng)的影響,為家畜體外受精及囊胚接種細胞建系提供參考。本研究首先探討LPA對綿羊體外受精早期胚胎發(fā)育的影響。我們選取了兩種成熟液,成熟液1與成熟液2,與兩種SOF液進行組合,通過比較不同體系間的成熟率、卵裂率和囊胚率,最終找到最優(yōu)的體外受精的體系即成熟液1+SOF2。然后,我們在綿羊卵母細胞體外成熟、體外受精和受精卵體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度的LPA,統(tǒng)計不同LPA濃度對體外受精過程中成熟率、卵裂率及囊胚率的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)LPA濃度為0.1μM、1μM及10μM之間時,隨著LPA濃度的增加,綿羊卵母細胞體外成熟率、卵裂率、囊胚率逐漸上升,且囊胚形態(tài)正常;但當(dāng)LPA濃度達到15 μM時,成熟率、卵裂率、囊胚率出現(xiàn)下降,并且囊胚形態(tài)發(fā)生異常,胚胎內(nèi)細胞團聚集不正常,囊胚內(nèi)部出現(xiàn)分區(qū),不能發(fā)育成為優(yōu)質(zhì)的囊胚。為了檢測在不同濃度LPA的刺激下,LPARs及干性標(biāo)記基因OCT-4與CDX-2在早期胚胎中的表達量,我們通過實時定量PCR檢測了LPAR1 LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、OCT-4 與 CDX-2 在 2 細胞期、4 細胞期、8細胞期、桑葚胚期和囊胚期中的表達情況。結(jié)果顯示,在不同LPA濃度下,LPARs在早期胚胎各個時期均有表達,其中LPAR2的表達量明顯高于其他5種受體的表達量,LPAR4表達量僅低于LPAR2,LPAR1與LPAR3表達量較接近,LPAR5與LPAR6表達量較為接近,但LPAR1、LPAR3、LPAR5與LPAR6表達量極低。LPAR2與LPAR4表達量在2細胞時期到囊胚期呈現(xiàn)上升趨勢,且當(dāng)LPA濃度為0-10μM時,隨著LPA濃度的增加而增加,而當(dāng)LPA濃度為15μM時,二者的表達量卻出現(xiàn)抑制。為了探討LPA濃度對囊胚接種細胞培養(yǎng)的影響,我們在囊胚接種細胞培養(yǎng)體系中添加不同濃度的LPA,觀察不同體系下囊胚接種細胞的生長情況,通過免疫熒光染色與實時熒光定量PCR來檢測細胞中干細胞多能性標(biāo)志物OCT4及滋養(yǎng)層干細胞標(biāo)志基因CDX2的表達。我們選取GFF為飼養(yǎng)層,2i為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系,與Wnt-3a、hLif、Forskolin及LPA組合形成8種培養(yǎng)體系。結(jié)果顯示只添加2i培養(yǎng)液囊胚接種細胞生長緩慢,且出現(xiàn)分化現(xiàn)象;培養(yǎng)體系添加2i與Wnt-3a,貼壁囊胚長出扁平片狀結(jié)構(gòu),單層細胞下有液體積聚成穹窿狀結(jié)構(gòu),與滋養(yǎng)層干細胞相似,呈OCT4與CDX2陽性;體系為2i加hLif,貼壁囊胚細胞克隆較為致密,其形態(tài)類似于小鼠胚胎干細胞,成三維立體生長,OCT4呈陽性CDX2呈陰性。在2i與hLif培養(yǎng)體系中添加Forskolin,囊胚接種細胞呈扁平片狀生長,呈OCT4與CDX2陽性。取不同濃度LPA與2i、hLif、Forskolin組合,發(fā)現(xiàn)隨著LPA濃度的增加,囊胚接種細胞呈扁平片狀生長,細胞克隆的細胞核和細胞輪廓清晰,片狀細胞克隆邊緣出現(xiàn)增厚,甚至出現(xiàn)類似于牛胚胎干細胞的穹窿狀結(jié)構(gòu),出現(xiàn)形成滋養(yǎng)層干細胞的趨勢。在OCT4與CDX2的免疫熒光染色中,熒光強度在一定程度上隨著LPA濃度的增加而增強。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,OCT4與CDX2表達量隨LPA濃度的增大而增大,但過高濃度LPA卻會抑制OCT4與CDX2表達量。綜合上述實驗結(jié)果,可見LPA在綿羊體外受精早期胚胎發(fā)育及囊胚接種細胞培養(yǎng)中有著重要作用,本研究為家畜體外受精及干細胞研究提供一定的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S826

【參考文獻】

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本文編號：1619106