本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體膜蛋白Tp92致炎作用機(jī)制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文選擇在機(jī)體非特異性免疫中發(fā)揮重要抗感染作用的巨噬細(xì)胞和梅毒螺旋體早期感染中主要接觸的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)為靶細(xì)胞,來探討Tp92是否可作為一個(gè)觸發(fā)器啟動(dòng)宿主細(xì)胞主要炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并篩選出Tp92可能的靶細(xì)胞炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為進(jìn)一步揭示Tp致病的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)用Tp92蛋白分別刺激巨噬細(xì)胞和HMEC-1細(xì)胞,ELISA檢測(cè)其促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。并根據(jù)預(yù)測(cè)的My D88/NF-κB、MAPKs/p38和NLRP3/Caspase-1三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,分別用其特異性抑制劑PDTC(Pyrrolidinedithiocarbamic acid)、SB202190和Z-YVAD-FMK阻斷,ELISA檢測(cè)Tp92作用靶細(xì)胞前后促炎細(xì)胞因子的分泌水平差異。若促炎細(xì)胞因子分泌水平有顯著下降,既用Western blot檢測(cè)Tp92作用靶細(xì)胞前后My D88、NF-κB、MAPK1/2、p38 MAPK、Caspase-1和NLRP3分子的表達(dá)水平差異;最后通過總活性比色法定量檢測(cè)Tp92作用靶細(xì)胞前后乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性變化。研究結(jié)果如下:有效表達(dá)一個(gè)約92k Da大小的分泌性蛋白,經(jīng)純化后純度達(dá)85%以上;一定濃度的Tp92蛋白可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和HMEC-1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6;特異性阻斷My D88/NF-κB和MAPKs/p38信號(hào)通路后,ELISA結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞和HMEC-1細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子較阻斷前均無明顯降低,LDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示LDH的活性也無明顯差異,而特異性阻斷NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路后,ELISA結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞和HMEC-1細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β較阻斷前有明顯降低(P0.05);Western blot結(jié)果顯示Caspase-1和NLRP3分子的表達(dá)水平較阻斷前均有明顯降低;LDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示LDH的活性較阻斷前也有明顯降低(P0.01)。本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論,Tp92能促進(jìn)巨噬細(xì)胞和HMEC-1細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6,并且Tp92致使巨噬細(xì)胞和HMEC-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)可能是通過NLRP3/Caspase-1途徑。
【關(guān)鍵詞】：梅毒螺旋體 Tp92 炎癥 信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R759.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 緒論12-16
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料16-20
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 2.2 載體、菌株及細(xì)胞株17
• 2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑17-20
• 2.3.1 主要試劑盒17
• 2.3.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑17-18
• 2.3.3 培養(yǎng)基及溶液18-19
• 2.3.4 其他19-20
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法20-40
• 3.1 Tp92目的基因的擴(kuò)增20-23
• 3.1.1 Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株全基因組DNA模板的提取20-21
• 3.1.2 Tp92的引物設(shè)計(jì)21
• 3.1.3 PCR擴(kuò)增21-22
• 3.1.4 PCR產(chǎn)物的純化22-23
• 3.2 構(gòu)建Tp92原核表達(dá)載體23-28
• 3.2.1 pET-43.1a(+)質(zhì)粒的擴(kuò)增與純化23-25
• 3.2.2 制備感受態(tài)細(xì)菌25-26
• 3.2.3 Tp92和pET-43.1a(+)質(zhì)粒的雙酶切26
• 3.2.4 純化雙酶切后的Tp92和pET-43.1a(+)質(zhì)粒26
• 3.2.5 Tp92和pET-43.1a(+)質(zhì)粒的連接26-27
• 3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化27
• 3.2.7 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定27-28
• 3.3 Tp92重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定28-33
• 3.3.1 摸索Tp92重組蛋白的最佳表達(dá)條件28
• 3.3.2 Tp92重組蛋白的純化28-30
• 3.3.3 Tp92重組蛋白的濃縮30-31
• 3.3.4 Tp92重組蛋白去內(nèi)毒素31
• 3.3.5 Western Blot鑒定31-32
• 3.3.6 蛋白濃度的測(cè)定32-33
• 3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代33
• 3.4.1 THP-1 細(xì)胞33
• 3.4.2 HMEC-1 細(xì)胞33
• 3.5 初步探索Tp92的致炎作用33-36
• 3.5.1 Tp92刺激靶細(xì)胞33-35
• 3.5.2 ELISA檢測(cè)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平35-36
• 3.6 ELISA檢測(cè)阻斷各信號(hào)通路前后各促炎細(xì)胞因子的水平變化36-37
• 3.6.1 巨噬細(xì)胞36
• 3.6.2 HMEC-1 細(xì)胞36-37
• 3.7 Western Blot檢測(cè)阻斷各信號(hào)通路前后關(guān)鍵分子的水平變化37-38
• 3.7.1 巨噬細(xì)胞37
• 3.7.2 HMEC-1 細(xì)胞37-38
• 3.7.3 Western Blot檢測(cè)38
• 3.8 LDH法檢測(cè)阻斷各信號(hào)通路前后靶細(xì)胞內(nèi)LDH的水平變化38-40
• 3.8.1 巨噬細(xì)胞38-39
• 3.8.2 HMEC-1 細(xì)胞39
• 3.8.3 乳酸脫氫酶檢測(cè)39-40
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-56
• 4.1 Tp92目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定40-44
• 4.1.1 Tp92基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果40
• 4.1.2 Tp92/pET-43.1a(+)重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定40-41
• 4.1.3 Tp92/pET-43.1a(+)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定41-42
• 4.1.4 Blast比對(duì)42
• 4.1.5 Tp92重組蛋白的表達(dá)42-43
• 4.1.6 Tp92重組蛋白純化、去內(nèi)毒素之后的Western Blot分析43-44
• 4.1.7 測(cè)定Tp92重組蛋白最終濃度44
• 4.2 Tp92刺激不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響44-47
• 4.3 PDTC對(duì)Tp92誘導(dǎo)靶細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子的影響47-48
• 4.4 SB202190對(duì)Tp92誘導(dǎo)靶細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子的影響48-50
• 4.5 Z-YVAD-FMK對(duì)Csapase-1 和NLRP3的表達(dá)及促炎細(xì)胞因子的分泌的影響50-53
• 4.6 LDH法檢測(cè)阻斷各信號(hào)通路前后靶細(xì)胞內(nèi)LDH的水平變化53-56
• 第5章 討論56-62
• 第6章 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 文獻(xiàn)綜述70-100
• 梅毒螺旋體外膜蛋白 Tp92 及其同源蛋白的研究進(jìn)展70-81
• 參考文獻(xiàn)77-81
• Autophagy, an inhibitor of NLRP3 inflammasome activation81-100
• References92-100
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果100-102
• 致謝102

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳冷;王駿;趙蕾;吳亞菲;;核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域亞家族成員3炎癥小體的活化調(diào)節(jié)與牙周疾病的關(guān)系[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2015年06期

2 甘霖;趙飛駿;;梅毒螺旋體外膜蛋白Tp92及其同源蛋白的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2014年01期

  本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體膜蛋白Tp92致炎作用機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：313279