目的:分析評價來自我國三個內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)利什曼原蟲分離株遺傳和感染力的差異。方法:通過設(shè)計特異引物擴增來自我國不同利什曼病流行區(qū)利什曼原蟲分離株的hsp70和ITS 1序列,構(gòu)建進化樹以闡明其遺傳關(guān)系;選擇來自三個黑熱病流行區(qū)的3個代表性分離株前鞭毛體分別接種于NNN培養(yǎng)基、M199+20%胎牛血清培養(yǎng)基、M199+20%馬血清培養(yǎng)基及腦心浸液培養(yǎng)基,構(gòu)建生長曲線;應(yīng)用合適培養(yǎng)基培養(yǎng)利什曼原蟲,收集處于穩(wěn)定生長期的前鞭毛體感染BALB/c小鼠,分別于感染后的1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周處死小鼠取樣,用qPCR絕對定量法檢測小鼠肝臟、脾臟蟲荷,用ELISA法檢測小鼠血清中的特異性抗體IgG、IgG1、IgG2a、IgM及細胞因子IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ、TGF-β的水平。結(jié)果:應(yīng)用特異于利什曼原蟲hsp70序列的引物從我國10個利什曼原蟲分離株均擴增出 1442bp片段,分離株JIASHI-1、JIASHI-5、XJ771、KXG-Xu、KXG-Liu、927、Cy、SC6序列間的同源性為100%,801和KS-2分離株同源性為100%,分離株序列間僅有1個堿基顯示差異。應(yīng)用特異于利什曼原蟲ITS1序列的引物,從來自人-犬共患型內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)的SC6和Cy分離株均擴增出318bp片段;從來自新疆克拉瑪依皮膚利什曼病流行區(qū)的KXG-Xu、KXG-Liu和927分離株均擴增出312bp片段;從來自新疆自然疫源型內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)的JIASHI-1、JIASHI-5和XJ771分離株均擴增出313bp片段;從來自新疆喀什人源型內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)的801和KS-2分離株均擴增出316bp片段。序列比對分析顯示來自相同流行區(qū)的利什曼原蟲分離株的ITS1序列完全相同。構(gòu)建的進化樹顯示10個分離株聚集成2個群和3個亞群:Ⅰ群包括A亞群和B亞群,屬嬰兒利什曼原蟲,Ⅱ群為杜氏利什曼原蟲。來自不同內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)的代表性利什曼原蟲分離株KS-2、Cy和JIASHI-5均能在NNN培養(yǎng)基、M199+20%胎牛血清培養(yǎng)基和M199+20%馬血清培養(yǎng)基生長繁殖,KS-2分離株在相應(yīng)培養(yǎng)基上繁殖最快。分別應(yīng)用利什曼原蟲分離株KS-2、Cy和JIASHI-5前鞭毛體感染BALB/c小鼠。在肝臟,KS-2分離株感染鼠蟲荷最多,在感染第4周時達到峰值,隨后逐漸減少至較低水平,第12周時最少。JIASHI-5分離株感染鼠蟲荷在感染后第1周時達到峰值,隨后逐漸減少,在感染10周時最少。Cy分離株感染鼠蟲荷最少,在第4周時達到峰值,隨后緩慢減少,第8周時最少。在感染的各時段以KS-2分離株感染鼠蟲荷最多,JIASHI-5蟲株感染鼠次之。在脾臟,以KS-2分離株感染鼠蟲荷最多,感染前2周時蟲荷較少,在感染6周時達到峰值,隨后有所減少。感染JIASHI-5分離株后,前2周只能在脾臟中檢測到極少的蟲荷,第4周時達到峰值,隨后逐漸減少。Cy分離株感染鼠蟲荷最少,在第6周時達到峰值,隨后逐漸減少。在感染的各時段以KS-2分離株感染鼠蟲荷最多,JIASHI-5蟲株感染鼠次之。三個利什曼原蟲分離株感染鼠血清中細胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-10濃度均升高,其中以KS-2感染鼠3種細胞因子增加均最高;IL-2、IL-12濃度均降低。三個利什曼原蟲分離株感染鼠血清中均檢測到利什曼原蟲特異的IgM、IgG、IgG1和IgG2a抗體,且隨感染進程相應(yīng)特異抗體水平均呈上升之勢。Cy分離株感染鼠IgM、IgG和IgG2a抗體水平在整個觀察期間均低于KS-2和JIASHI-5分離株感染鼠相應(yīng)特異抗體水平。結(jié)論:1.來自三個黑熱病流行區(qū)的利什曼原蟲分離株存在遺傳差異。2.來自三個流行區(qū)的利什曼原蟲分離株在不同培養(yǎng)基中生長繁殖存在差異。3.來自三個流行區(qū)的利什曼原蟲分離株對BALB/c小鼠的感染力及誘導(dǎo)的小鼠細胞免疫和體液免疫也存在差異。
【學(xué)位單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R531.6
【部分圖文】：

圖２基于利什曼原蟲ｈｓｐ７０基因序列以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ邋ｈｓｐ７０邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ逡逑２．１．２基于ＩＴＳ邋１序列分析逡逑應(yīng)用所設(shè)計特異擴增利什曼原蟲ＩＴＳ１序列的引物從１０株分離于我國不同利逡逑什曼病流行區(qū)的利什曼原蟲分離株均擴增出一單一片段（圖３），測序顯示，從逡逑不同分離株擴增的ＩＴＳ１序列長度為３１２ｂｐ－３１８ｂｐ（表２）。其中，來自新疆克拉瑪逡逑依皮膚利什曼病流行區(qū)的３個分離株ＫＸＧ－Ｘｕ、ＫＸＧ－Ｌｉｕ、９２７均擴增出３１２ｂｐ逡逑．片段；來自新疆自然疫源型內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)的３個分離株ＪＩＡＳＨＩ－１、逡逑ＪＩＡＳＨＩ－５和ＸＪ７７１均擴增出３１３ｂｐ片段；來自新疆喀什人源型內(nèi)臟利什曼病流逡逑行區(qū)的２個分離株８０１和ＫＳ－２均擴增出３１６ｂｐ片段；來自人－犬共患型內(nèi)臟利什逡逑１６逡逑

序列（表３）構(gòu)建進化樹以分析這些分離株的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示我國１０株利邐．逡逑什曼原蟲分離株聚集成兩個群（Ｉ和ＩＩ邋）和３個亞群（Ａ、Ｂ、Ｃ）（圖５），邋ＪＩＡＳＨＩ－１、逡逑ＪＩＡＳＨＩ－５和ＸＪ７７１分離株聚集為Ａ群，ＫＸＧ－Ｘｕ、ＫＸＧ－Ｌｉｕ、９２７分離株聚集為逡逑Ｂ邋群，他們與嬰兒利什曼原蟲邋ＭＨＯＭ／ＵＺ／２００７／ＯＢＡ、ＭＨＯＭ／ＩＲ／０４／ＩＰＩ－ＵＮ１０、逡逑ＭＨＯＭ／ＵＺ／２００７／ＭＵＡ邋及邋ＭＨＯＭ／ＢＲ／７４／ＰＰ７５邋分離株聚集在群邋Ｉ邋；邋Ｃｙ、ＳＣ６、８０１逡逑和ＫＳ２分離株與杜氏利什曼原蟲分離株ＭＨＯＭ／ＩＮ／８０／ＤＤ８、逡逑ＭＨＯＭ／ＥＴ／０８／ＤＭ３０９－Ｃ１３、ＭＨＯＭ／ＥＴ／０８／ＤＭ３０９－Ｃ１１邋和邋ＭＨＯＭ／ＫＥ／７５／Ｈ９邋聚集逡逑為Ｃ群

純化后的濃度為９６ｎｇ／ｐｌ。應(yīng)用此擴增產(chǎn)物ｋ行焚光定量ＰＣＲ擴增，繪制絕逡逑對定量法標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為ｙ＝－３．３７４１0ｇｘ＋４０．２５７邋（圖９），且熔解逡逑曲線呈單一峰（圖１０），ＰＣＲ產(chǎn)物單一，表明標(biāo)準(zhǔn)品ＤＮＡ純度高。逡逑舉．１…逡逑．１．逡逑－Ｉ，—逡逑Ｍ：ＤＮＡ標(biāo)志物１？３：依次為我國流行區(qū)分離的利什曼原蟲分離株ＫＳ－２、Ｃｙ、ＪＩＡＳＨＩ－５；Ｎ：逡逑陰性對照逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？３邋Ｔｈｅ邐ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｎｄｅｍｉｃ邋ａｒｅａｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎａ，邋ＫＳ－２、Ｃｙ、逡逑ＪＩＡＳＨＩ－５；邋Ｎ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑圖８我國利什曼原蟲分離株ＳＳＵｒＲＮＡ序列ＰＣＲ擴增產(chǎn)物電泳圖逡逑Ｆｉｇ．邋８邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＳＳＵｒＲＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｆｒｏｍ

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3 王明榮;血吸蟲病流行與胃癌、肝癌、腸癌的關(guān)系[J];癌癥;1988年01期

4 高曉峰,陸志云,毛淑真,項淑男;耕牛血吸蟲病流行區(qū)血清免疫診斷價值的探討[J];中國獸醫(yī)雜志;1988年06期

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本文編號：2820403