發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 02:21

【摘要】：背景及目的HIV-1感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者(Long term non-progressors,LTNPs)是能天然控制HIV、維持宿主良好免疫的一類特殊人群,其機(jī)制與病毒、宿主遺傳特征、免疫應(yīng)答等多種因素有關(guān),但天然免疫激活水平與長(zhǎng)期不進(jìn)展的關(guān)系尚未明確。本研究基于全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序展示HIV-1感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者和典型進(jìn)展者的mRNA和非編碼RNA表達(dá)譜,通過(guò)功能富集分析和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,從全轉(zhuǎn)錄水平分析mRNA和編碼RNA在HIV-1感染長(zhǎng)期不進(jìn)展中的作用,并基于測(cè)序結(jié)果,在人群水平深入探討關(guān)鍵天然免疫信號(hào)通路的激活水平與HIV-1感染長(zhǎng)期不進(jìn)展的關(guān)系。方法1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)分析:選取3例HIV-1感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者和3例典型進(jìn)展者,采集靜脈血,分離PBMC并提取總RNA,構(gòu)建cDNA文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾和注釋,獲得mRNA、lncRNA、small RNA和circRNA的表達(dá)量并進(jìn)行差異表達(dá)分析。2.功能富集分析:對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。對(duì)差異表達(dá)lncRNA、small RNA和circRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。3.ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果,對(duì)具有靶向關(guān)系的差異lncRNA、miRNA、mRNA進(jìn)行共表達(dá)分析,表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)的miRNA-mRNA對(duì)、miRNA-lncRNA對(duì),經(jīng)過(guò)超幾何分布檢驗(yàn)篩選lncRNA-miRNAmRNA互作關(guān)系,構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。以同樣的方法構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。4.NOD樣受體信號(hào)通路激活水平檢測(cè):招募HIV-1感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者(LTNPs組)、典型進(jìn)展者(TPs組)、抗病毒治療患者(ART組)和健康對(duì)照者(HC組),采集靜脈血,分離PBMC。使用PCR檢測(cè)NOD樣受體信號(hào)通路中NLRP3、IL-1β和caspase-1的mRNA表達(dá)水平,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組人群caspase-1即細(xì)胞焦亡發(fā)生水平,ELISA檢測(cè)血漿中caspase-1、IL-1β含量。5.胞內(nèi)DNA識(shí)別信號(hào)通路激活水平檢測(cè):PCR檢測(cè)NOD樣受體信號(hào)通路cGAS、IFI16等因子的mRNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)IFI16、STING蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.差異表達(dá)mRNA及其功能:與典型進(jìn)展者相比,長(zhǎng)期不進(jìn)展者中差異表達(dá)的mRNA有543個(gè),其中上調(diào)的mRNA 205個(gè),下調(diào)338個(gè)。GO富集顯示差異表達(dá)mRNA主要富集在胞內(nèi)過(guò)程、細(xì)胞組分、催化活性等二級(jí)GO條目。KEGG富集分析顯示,差異表達(dá)mRNA主要富集在胞內(nèi)DNA識(shí)別通路、NOD樣受體信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等天然免疫相關(guān)信號(hào)通路。2.差異表達(dá)lncRNA及功能:共發(fā)現(xiàn)1297個(gè)差異表達(dá)lncRNA,長(zhǎng)期不進(jìn)展者中上調(diào)的lncRNA 1108個(gè),下調(diào)的lncRNA 189個(gè),其中負(fù)調(diào)控宿主抗病毒應(yīng)答的lncRNA-NRAV在LTNP組表達(dá)下調(diào)。3.差異表達(dá)small RNA、circRNA及其功能:兩組間差異表達(dá)的small RNA有45個(gè),已有功能報(bào)道的miRNA有8個(gè)。兩組間差異表達(dá)的circRNA155個(gè),均為本次研究新預(yù)測(cè)的circRNA,其中circRNA 090的來(lái)源基因?yàn)镹LRP3。4.lncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)包含14個(gè)miRNA、16個(gè)lncRNA和64個(gè)mRNA構(gòu)成的100對(duì)互作關(guān)系,circRNA-miRNA-mRNA包含17個(gè)miRNA、34個(gè)circRNA和71個(gè)mRNA構(gòu)成的142對(duì)互作關(guān)系。T細(xì)胞專向分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子TCF7均處于以上兩個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中。5.NOD樣受體信號(hào)通路激活水平:LTNPs組、TPs組、ART組和HC組四組人群NOD信號(hào)通路中NLRP3的mRNA表達(dá)量分別為4.14±3.76、1.90±1.57、2.60±2.73、1.33±1.23,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.202,P=0.030),LTNPs組表達(dá)量高于TPs組(t=2.542,P=0.015)。在NLRP3誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡發(fā)生水平方面,四組人群外周血PBMC發(fā)生焦亡的水平均較低,caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.529,P=0.672)。同樣,血漿的caspase-1含量也未在各組發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.852,P=0.475)。在通路下游炎癥因子方面,四組人群IL-1β的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.胞內(nèi)DNA識(shí)別信號(hào)通路激活水平:四組人群胞內(nèi)DNA識(shí)別信號(hào)通路中,模式識(shí)別受體cGAS和IFI16的mRNA表達(dá)水平在各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),并且LTNPs組均低于TPs組(P0.01);通路關(guān)鍵中間因子STING和TBK1的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì),LTNPs組均低于低于TPs組(P=0.024);進(jìn)一步在蛋白水平發(fā)現(xiàn),LTNPs組和TPs組IFI16蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.19±0.08、0.54±0.19,LTNPs組低于TPs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.908,P=0.044);而STING在LTNPs組和TPs組的蛋白相對(duì)表達(dá)也存在顯著差異(t=3.015,P=0.039),平均值分別為1.85±0.73、3.37±0.47,LTNP組低于TP組。結(jié)論1.HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展人群和典型進(jìn)展人群的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA表達(dá)譜存在較大的差異,富集到多條天然免疫通路可能與HIV長(zhǎng)期不進(jìn)展相關(guān),而非編碼RNA可能通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控天然免疫通路中關(guān)鍵因子mRNA的表達(dá)。2.在HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者人群中,未發(fā)現(xiàn)NOD樣受體信號(hào)通路的激活,但胞內(nèi)DNA識(shí)別信號(hào)通路的cGAS/IFI16-STING的激活水平明顯被抑制,這可能是該人群的疾病不進(jìn)展的原因之一。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R512.91
【圖文】：

圖 1- 1 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程圖Figure 1- 1 Flow chart of transcriptome sequencing and data analysis.2.2 確定研究對(duì)象研究遵循知情同意的原則，并由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批，在靈山縣疾控中心、柳州市疾控中心等地招募符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象究對(duì)象分為 HIV-1 感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者（LTNPs 組）和 HIV-1 感染典型進(jìn)者（TPs 組）。在參考既往文獻(xiàn)[50, 51]的基礎(chǔ)上，結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，定本研究中對(duì)象的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)。研究對(duì)象納入和排除標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表 1-1

HIV-1 感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析以及關(guān)鍵天然免疫通路激活水平研究 2019 屆博士學(xué)位論文4) mRNA 聚類分析為了顯示 mRNA 在每個(gè)樣本的表達(dá)情況，對(duì)兩組樣本的 mRNA 表達(dá)量進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，LTNPs 組三個(gè)樣本、TPs 組三個(gè)樣本分別聚在不同的 cluster 中，同組樣本基因表達(dá)具有相同的趨勢(shì)，不同組樣本在基因的表達(dá)上呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)。（圖 1- 2）

HIV-1 感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析以及關(guān)鍵天然免疫通路激活水平研究 2019 屆博士學(xué)位論文5) mRNA 組間差異分析組間差異分析即篩選出不同組間存在差異表達(dá)的 mRNA，我們以差異倍數(shù)≥2 倍及 padj ≤0.05 為條件篩選兩組間差異表達(dá)的 mRNA，并繪制火山圖（圖 1-3）。結(jié)果顯示，兩組共有 543 個(gè)差異表達(dá)的 mRNA，與 TPs 組相比，LTNPs 組上調(diào)的 mRNA 有 205 個(gè)，下調(diào)的 mRNA 有 338 個(gè)（圖 1-4）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王丹;王昆華;;HIV感染期間持續(xù)性免疫激活與腸道微生物易位關(guān)系的研究[J];腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng);2015年01期

本文編號(hào)：2766716