【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染及其引起的一系列相關疾病是一種嚴重影響人類健康的全球性疾病,世界各國的科學家們從不同的方面對HBV感染的有效防治進行了大量的相關研究、探索和嘗試。乙肝疫苗、干擾素(Interferon,INF)和核苷(酸)類似物(Nucleotide analogues,Nas)是現(xiàn)階段防治慢性乙型肝炎病毒感染有效的主要手段,乙肝疫苗雖然可起到預防作用,但對已感染者、免疫耐受者和病毒逃逸株無效,而現(xiàn)階段使用的抗病毒藥物,存在副作用較大(干擾素)、易產(chǎn)生耐藥(核苷類藥物)、抗原血清轉(zhuǎn)換率低等諸多缺點。建立細胞模型是研究病毒感染史、生物學特性、評價藥物療效、優(yōu)化治療方案、研究高效疫苗和開發(fā)新產(chǎn)品高效便捷的技術手段�，F(xiàn)有的細胞模型包括病毒感染細胞模型、病毒瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型和病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型。對于病毒感染細胞模型,雖然近年發(fā)現(xiàn)了HBV的受體分子鈉離子一�；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP),但其感染效率仍然較低并且操作復雜,另外由于HBV嚴格的物種和組織特異性屬性,限制了此種細胞模型的應用,病毒的瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在肝癌細胞中的病毒復制很難長期保持穩(wěn)定,不適合實驗的標準化的需要,如藥物敏感試驗。20余年來國內(nèi)外已經(jīng)建立了可以復制和分泌HBV病毒顆粒的穩(wěn)定細胞系,如國際上公認的Hep G2.2.15細胞和Hep AD38細胞。其他實驗室為了滿足抗病毒耐藥變異研究的需求,也相繼建立起了耐藥突變的HBV穩(wěn)定復制細胞株,但仍然缺少我國流行的(B和C基因型)HBV毒株穩(wěn)定復制細胞系和多重耐藥細胞株;另外一些細胞株人為誘導的HBV突變細胞株,不能反映出病毒的自然遺傳特征。因此,建立HBV中國流行株B和C基因型穩(wěn)定復制細胞模型,符合我國臨床實際,對于抗病毒藥物的評價及乙肝防治方案的本土化具有積極作用。本實驗室在前期的工作中通過聯(lián)合應用PB轉(zhuǎn)座子及其他技術構建了中國流行株C基因型野生株和耐藥株的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,本研究旨在對此穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的各項指標進行分析,并將其初步應用在體外抗HBV藥效學評價上,期望該穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞能夠為抗HBV新藥藥效評價提供理想的細胞模型。目的:檢測分析本實驗室前期構建的HBV中國流行株C基因型穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞:Hep G2.CW和Hep G2.LER細胞系的各項復制指標,評價該穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞特性與經(jīng)典HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模型的差異;用臨床常用核苷類藥物來評價穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系用于藥物評價的可靠性;設計用于表達新型小發(fā)卡rna(shorthairpinrna,shrna)的慢病毒載體,并考察其用于抗乙型肝炎病毒的可行性。方法:1、hbv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞特征分析:1)化學發(fā)光法定量檢測hepg2.cw和hepg2.ler細胞上清hbv表面抗原(hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag)的表達和e抗原(hepatitisbviruseantigen,hbeag)的表達;2)熒光定量rcr法檢測hepg2.cw和hepg2.ler細胞上清hbvdna的含量;3)酶聯(lián)免疫吸附法定性檢測胞內(nèi)乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的表達;4)間接免疫熒光法檢測胞內(nèi)乙型肝炎病毒表面抗原的表達;5)間接免疫熒光法檢測胞內(nèi)乙型肝炎病毒核心抗原的表達;6)酶聯(lián)免疫吸附法定性檢測hepg2.cw和hepg2.ler細胞系細胞上清乙型肝炎病毒前s1抗原(hbvpres1)的表達。2、用臨床常用核苷類藥物來評價hepg2.cw和hepg2.ler細胞系用于藥物評價的可靠性:選用我國三種臨床常用核苷類藥物:拉米夫定(lam)、恩替卡韋(etv)、阿德福韋酯(adv),稀釋為0、0.001、0.01、0.1、1、10、100μm的一系列的濃度梯度,分別作用于hepad38(陽性對照)、hepg2.cw和hepg2.ler三種細胞系,連續(xù)正常培養(yǎng)九天后用熒光定量rcr法檢測三種細胞上清乙型肝炎病毒dna的含量。3、新型小發(fā)卡rna慢病毒表達載體的構建及抗乙型肝炎病毒應用評價:對慢病毒載體骨架sapi位點進行突變,并將用于表達新型小發(fā)卡rna的結構亞克隆到改造后的慢病毒載體;設計靶向hbv保守序列的shrna并克隆到該慢病毒載體,包裝含有shrna序列的重組慢病毒并進行定量,考察單個及多個shrna結構串聯(lián)對慢病毒滴度的影響;將重組慢病毒感染hbv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝細胞系hepg2.cw(moi=3),用l3稻霉素(blasticidin)篩選穩(wěn)定克隆1周后,將其重新消化,并以1×105/孔接種于24孔板中,于鋪板96h后取細胞上清檢測hbsag、hbeag表達水平和hbvdna的含量。結果:1、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞特征分析結果:1)陽性對照hepg2.2.15細胞上清hbsag表達水平約為79ng/ml,hepg2.cw和hepg2.ler細胞上清hbsag表達水平約為85ng/ml和8ng/ml;2)陽性對照的hepg2.2.15細胞上清hbeag表達水平約為63ncu/ml,hepg2.cw和hepg2.ler細胞上清hbeag表達水平約為78ncu/ml和70ncu/ml;3)hepg2.cw和hepg2.ler細胞的hbvdna的含量均比陽性對照細胞hepg2.2.15高;4)hepg2.cw細胞胞內(nèi)hbsag的表達水平比陽性對照hepad38細胞高,而hbeag的表達水平就比陽性對照hepad38細胞低;hepg2.ler細胞胞內(nèi)hbsag和hbeag的表達水平均比陽性對照hepad38細胞低;5)hepg2.cw和hepg2.ler兩種細胞系均有較好的表面抗原表達;6)hepg2.cw和hepg2.ler兩種細胞系均有較好的核心抗原表達;7)陽性對照Hep AD38細胞上清HBV Pre S1表達水平OD值約為2.5,Hep G2.CW和Hep G2.LER細胞上清HBV Pre S1表達水平OD值約為3.5和0.8。2、用臨床常用核苷類藥物來評價Hep G2.CW和Hep G2.LER細胞系用于藥物評價的可靠性,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加,陽性對照細胞Hep AD38和待評價細胞Hep G2.CW細胞上清HBV DNA的量均出現(xiàn)均勻的下降趨勢;而Hep G2.LER細胞上清HBV DNA對LAM和ETV敏感度下降,ETV的作用也僅在藥物濃度1μM之后對HBV DNA的量有一定抑制趨勢,ADV在藥物濃度0.1μM時即對HBV DNA的量有明顯的抑制。3、構建了一種用于表達新型小發(fā)卡RNA的慢病毒載體,通過設計靶向HBV保守序列的sh RNA實現(xiàn)了HBV復制的高效抑制,發(fā)現(xiàn)兩個和三個sh RNA串聯(lián)效果優(yōu)于單個sh RNA。結論:1、兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系Hep G2.CW和Hep G2.LER細胞能夠穩(wěn)定支持HBV的復制和表達;2、Hep G2.CW對三種臨床常用抗乙肝核苷類藥物均敏,Hep G2.LER細胞株對LAM和ETV敏感度下降;3、本文構建的新型sh RNA慢病毒表達載體可作為防治慢性病毒感染如HBV感染的潛在有效手段之一。
【學位授予單位】：河南中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62

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