【摘要】：背景紅毛癬菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)在真菌感染中占很大比例,紅毛癬菌所致皮膚癬菌病呈現(xiàn)為慢性遷延性、易復(fù)發(fā)、難治愈,通常侵襲人類(lèi)淺表角質(zhì)結(jié)構(gòu),但是免疫抑制、外傷等情況下,紅毛癬菌能入侵深部組織結(jié)構(gòu),造成深部真菌感染。目前真菌感染的治療藥物由于副作用大、療程長(zhǎng),病人依從性差等,治療效果不理想,嚴(yán)重影響著病人的工作與生活。研究發(fā)現(xiàn),皮膚中有對(duì)抗真菌感染的一系列免疫細(xì)胞,如朗格漢斯細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等。其中角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte)能識(shí)別抗原、釋放多種抗菌肽、調(diào)節(jié)分泌炎癥因子,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,達(dá)到防御真菌感染的目的。作為皮膚的第一道防線,角質(zhì)形成細(xì)胞表面有各種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs),能識(shí)別紅毛癬菌表面的細(xì)胞壁成分病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生,啟動(dòng)進(jìn)一步免疫應(yīng)答。但是相比下,當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞與真菌相互識(shí)別反應(yīng)后,真菌本身會(huì)發(fā)生什么變化,真菌內(nèi)部具體的反應(yīng)機(jī)制尚未研究清楚。紅毛癬菌細(xì)胞內(nèi)大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性有一定的損傷作用,甚至導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡。在本研究中,我們主要探究當(dāng)紅毛癬菌侵襲角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí),真菌內(nèi)部的變化。我們將紅毛癬菌與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng),通過(guò)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)觀察角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)紅毛癬菌生長(zhǎng)是否有抑制作用,探討ROS和NO對(duì)紅毛癬菌的損傷作用。研究目的研究HaCaT細(xì)胞對(duì)T.rubrum生長(zhǎng)的抑制作用并探討其機(jī)制,為深入了解皮膚真菌與皮膚屏障之間的關(guān)系,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)皮膚真菌感染的免疫機(jī)制起了重要作用。方法(1)在合適的條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞與紅毛癬菌(ATCC4438),實(shí)驗(yàn)分組:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,分別進(jìn)行選擇合適的濃度比例及時(shí)間試驗(yàn),確定合適的共孵育濃度比例與時(shí)間。(2)通過(guò)實(shí)驗(yàn)分組:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,T.rubrum+DPI(NADPH氧化酶抑制劑)+HaCaT,測(cè)定真菌活力、ROS、角蛋白酶含量,掃描電鏡和透射電鏡觀察真菌形態(tài)變化。(3)通過(guò)實(shí)驗(yàn)分組:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,T.rubrum+L-NMMA(總NOS抑制劑)+HaCaT,測(cè)定真菌活力、NO、NOS及角蛋白酶含量,掃描電鏡和透射電鏡觀察真菌形態(tài)變化。(4)通過(guò)實(shí)驗(yàn)分組:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,測(cè)定真菌ADMA表達(dá)。結(jié)果(1)檢測(cè)真菌生長(zhǎng)抑制百分?jǐn)?shù)后,選定HaCaT細(xì)胞:T.rubrum合適濃度比例為4:1,HaCaT細(xì)胞與T.rubrum合適共孵育時(shí)間為24h,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)與HaCaT細(xì)胞共孵育后,T.rubrum活力下降,真菌形態(tài)出現(xiàn)損傷,ROS水平增加,角蛋白酶活性降低,DPI能降低HaCaT細(xì)胞的抑制作用。(3)與HaCaT細(xì)胞共孵育后,T.rubrum活力下降,真菌形態(tài)出現(xiàn)損傷,ADMA表達(dá)下降,NOS、NO表達(dá)增多,角蛋白酶活性降低,L-NMMA能降低HaCaT細(xì)胞的抑制作用。結(jié)論(1)T.rubrum與HaCaT細(xì)胞共孵育后可能通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量的ROS和NO,導(dǎo)致真菌的損傷,抑制了真菌的活力和侵襲力;(2)NADPH氧化酶和NOS可能是HaCaT細(xì)胞抑制T.rubrum生長(zhǎng)的靶點(diǎn);(3)為深入了解皮膚真菌與皮膚屏障之間的關(guān)系,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)皮膚真菌感染的免疫機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R756
【圖文】：

廔育２４ｈ后的生長(zhǎng)抑制率更明顯，所以我們選擇２４ｈ為Ｔ．邋ｒｕｂｒｕｍ和ＨａＣａＴ細(xì)逡逑胞共孵育的合適時(shí)間，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑圖２邋Ａ逡逑１２ｈ邐２４ｈ逡逑ｒ邋＇１邐ｒ－逡逑ｇｒｏｕｐ逡逑ｍｍ逡逑Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＨａＣａＴ邋ｃｅｌｌｓ：邋Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ＝４：ｌ）逡逑Ｂ逡逑２２逡逑

再和ＨａＣａＴ細(xì)胞共孵育，測(cè)得兩組間的真菌活性沒(méi)有明顯差異（Ｐ＞０．０５），所逡逑以選擇ＤＰＩ邋１邋（ｉＭ用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（Ｔ．邋ｒｕｂｒｕｍ組為對(duì)照組）逡逑圖３逡逑２３逡逑

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