【摘要】：目的:篩選DEx D/H-box家族中可能影響HBV增強(qiáng)子或核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的基因,初步研究DHX15對(duì)HBV復(fù)制的調(diào)控作用。方法:1.克隆DEx D/H-box家族基因到表達(dá)質(zhì)粒PCH9,并構(gòu)建由HBV增強(qiáng)子和核心啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pcore-Rluc;2.分別將各種DDX表達(dá)質(zhì)粒與pcore-Rluc共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,篩選影響Rluc熒光素酶活性的DDX家族成員。3.在HepG2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染HBV1.3倍體質(zhì)粒和DHX15表達(dá)質(zhì)粒,通過Western blot檢測(cè)DHX15在細(xì)胞中的表達(dá),用Southern blot、Northern blot檢測(cè)過表達(dá)DHX15對(duì)中HBV復(fù)制水平和轉(zhuǎn)錄水平的影響;4.構(gòu)建HBV增強(qiáng)子與核心啟動(dòng)子截短突變體,確定DHX15在HBV增強(qiáng)子或核心啟動(dòng)子上的作用區(qū)域。結(jié)果:1.成功構(gòu)建30種DEx D/H-box家族基因克隆;2.篩選出對(duì)HBV增強(qiáng)子/核心啟動(dòng)子有明顯影響的基因DHX15(P=0.042);3.與對(duì)照組相比,過表達(dá)DHX15能促進(jìn)HBV DNA的復(fù)制水平;并且能上調(diào)HBV RNA轉(zhuǎn)錄水平;4.成功構(gòu)建HBV核心啟動(dòng)子截短突變體,發(fā)現(xiàn)DHX15促進(jìn)HBV的復(fù)制是通過增強(qiáng)子實(shí)現(xiàn)的(t=8.292,P=0.0012;t=5.215,P=0.0064)。結(jié)論:過表達(dá)DHX15可通過影響HBV增強(qiáng)子的活性從而促進(jìn)HBV復(fù)制。
【圖文】：

HBV 增強(qiáng)子/核心啟動(dòng)子活性的 DEx D/H-box RNA 解旋酶HBV 核心啟動(dòng)子活性相對(duì)較弱，而海腎熒光素酶（Renilla Lucif靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，所以我們選用海腎熒光素酶為報(bào)告基因。利用 增強(qiáng)子/核心啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，我們進(jìn)行了熒光素酶篩選實(shí)驗(yàn)，以子/核心啟動(dòng)子活性有明顯影響的DEx D/H-box家族基因。從篩選結(jié)可以看出：DDX18、DDX19B、DDX39A、DDX39B、DDX55 和 有較顯著的正向調(diào)控作用，使海腎熒光素酶活性升高 2 倍以上，作用最為顯著，與對(duì)照相比，使 Rluc 活性升高 3 倍以上，用 BonP 值后得到 P=0.042，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此我們首先對(duì) DH究。

圖 3 DHX15 過表達(dá)在 HepG2 細(xì)胞中可促進(jìn) HBV 復(fù)制re 3 DHX15 promoted HBV DNAreplication in HepG HepG2 細(xì)胞中過表達(dá)增強(qiáng) HBV RNA 轉(zhuǎn)錄了 DHX15 對(duì) HBV DNA 復(fù)制具有正向調(diào)控作過增強(qiáng) HBV RNA 轉(zhuǎn)錄水平所引起的，我們又質(zhì)粒和空載體與 HBV1.3 共同轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后收orthern blot 檢測(cè)。結(jié)果（圖 4）顯示，在 HeBV mRNA 水平升高，提示 DHX15 可以上調(diào) H
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2596895